조직 및 질량 분석 이미징 사용 하 여 셀 사이의 작은 분자 통신 캡처
Summary
세포 및 조직 coculture 이미징 질량 분석을 사용 하 여 작은 분자 exchange 검색에 맞게 샘플 준비 하는 새로운 방법 개발 되었다.
Abstract
질량 분석 (IMS) 이미징 정기적으로에 적용 된 세 가지 유형의 샘플: 조직 섹션, spheroids, 그리고 미생물 식민지. 이러한 샘플 유형은 관심사의 생물학 견본에서 단백질, 지질, 및 대사 산물의 분포를 시각화 하는 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 비행 질량 분석 (MS MALDI TOF)를 사용 하 여 분석 되었습니다. 우리는 포유류 세포 배양에서 agarose로 시드 여 암, 화학 통신 식별 underexplored 접근을 해결 하기 위해 3 개의 이전 응용 프로그램의 장점을 결합 하 여 새로운 샘플 준비 방법 개발 건강 한 조직 샘플의 건조 뒤 coculture. 포유류 조직 및 세포는 조직과 세포 사이 보급을 통해 화학 통신을 허용 하는 가까운 근접에서 cocultured. 특정 시간 점에서 agarose 기반 샘플 미생물 식민지 IMS 분석에 대 한 준비와 같은 방식으로 건조 됩니다. 우리의 방법은 고급 액 난소 암 전이 동안 난소와 상호 작용 하는 나 팔 관에서 파생 된 간의 통신 모델을 개발 되었다. 샘플 준비의 최적화 결과 난소 microenvironment에서 주요 화학 성분으로 norepinephrine의 식별. 새로 개발된 된이 메서드는 인접 한 셀 또는 조직 간의 화학 커뮤니케이션의 이해를 필요로 하는 다른 생물 학적 시스템에 적용할 수 있습니다.
Introduction
3 널리 사용 되는 응용 프로그램에 기능을 분자의 공간 분포 특성에 최적화 된 질량 분석 (IMS) 이미징: 조직 슬라이스, spheroids, 및 미생물 식민지1,2,3. 조직 조각 호스트, 타겟 또는 특정 대량 범위 내에서 타겟이 불분명 한 생물학 상황의 맥락에서 대사 산물의 지역화를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그러나, 건강 한 조직 질병 상태, 예를 들어 종양에 비교 될 때 가장 중요 하 고 명백한 분자 기능 사이의 차이점은. 그러나 IMS 이렇게 질병 바이오 마커의 검출에 특히 적응은,, 질병의 진행 (예: 종양 등급)에 개별 단계에서 조직 샘플을 확보 하는 걸로의 개시에 대 한 중요 한 될 수 있는 신호 식별은 질병입니다. 공간을 통해 정보 교환 많은 생물 학적 시스템의 유비 쿼터 스 기능 이며 조직 조각이 동적 화학 릴레이 캡처할 수 없습니다. 화학 및 확산을 시각화 수 있는 1 개의 기술은 이다 한 천 배지;에 성장 하는 미생물 식민지의 IMS 작은 분자는 agar 전역을 통해 확산을 수 있으며 매트릭스 보조 레이저 탈 착 또는 이온화 (MALDI-TOF) 질량 분석4를 통해 캡처할 수 있습니다. 이 성장 설치 개별 생물 엔터티 (식민지) 간에 교환 하는 분자를 식별 하는 데 수 고 또한 대사 산물 생산의 방향성을 결정할 수 있습니다. 원래 미생물 식민지 성장을 위해 설계 된 플랫폼 적응 포유류 세포, 성장 조직 explants의 기본 신진 대사를 탐험 하 고 IMS는 생체 외에서 포유류 시스템에서 동적 화학 교환 평가 하는 데 사용 되었다.
지난 몇 년 동안, 그것은 분명 고급 액 난소 암 (HGSOC) 종종 나 팔 관 상피 (FTE)에서 유래 하 고 다음 초기 질병 개발5,6, 중 난소에 metastasizes 되고있다 7 , 8. tumorigenic FTE 확산 어디 결국 큰 종양 형성 및 전이 더, 난소 세포 이유 현재 명확 하지 않다. 이전 연구는 난소; 하 주 전이 난소 단백질의 역할에 집중 그러나, 그것은 최근 증명 되었습니다 tumorigenic 조직에 건강에서 전환 세포질 물질 대사의 대규모 장애 발생 및 작은 분자9,,1011의 생산을 변경. 따라서, 우리가 가설 작은 분자는 FTE 및 난소 사이 교환 분할 책임 있는 HGSOC의 주 전이 될 수 있습니다.
우리의 새로 개발된 된 IMS 절차를 사용 하 여, 우리 결정 coculture tumorigenic FTE 및 건강 한 난소 조직을 난소에서 norepinephrine의 생산을 유도 한다. 그러나, 다른 세포 유형 또는 정상적인 FTE 셀이이 효과 유도 하지 않았다. 이 방법의 특별 한 혜택은 분자 생산 및 실제 분자를 나타내는 신호를 교환 구상 될 수 있다, 그래서 심지어는 coculture에서는 신호의 소스를 확인할 수 있습니다. 이것이 무 균된 샘플의 분석에 이점을 모든 공간 정보가 손실 됩니다. 우리의 모델 시스템에서 명확 하 게 난소에 norepinephrine의 생산을 할당할 수 있었습니다. Norepinephrine 전이 및 chemoresistance 난소 암에 연결 되었습니다 및이 분자의 우리의 감지 소설 IMS 메서드 생물학 관련 분자12,13, 를 찾아낼 수 있습니다 확인 했다 14.이 유효성 검사 제안 하는 IMS의이 새로운 응용 프로그램 그룹을 coculture 환경에서 작은 분자를 식별 하 고 셀 변환에 영향을 주는 초기 이벤트를 이해 하는 것을 시도 하는 연구를 특히 도움이 될 수 있습니다 그리고 전이입니다. 이 방법의 전반적인 목표는 정체성과 조직 및 장기, 3D 세포 배양 체 외에서 또는 vivo 전 조직에 의해 표현 사이의 교환 동안 작은 분자의 공간적 분포를 명료 하 게.
Protocol
Representative Results
Discussion
HGSOC12,,1718, norepinephrine의 역할 연루 증거의 성장 시체 이며이 기술은 더 기계 정보를 기여 하고있다. 생물 학적 조건 같은 슬라이드에 적어도 8, 메서드 단일 IMS에 미디어 컨트롤 뿐만 아니라 유전자와 세포 특이성 run과 같은 생물 학적 컨트롤에 대 한 계정 수 있습니다. 메서드가 최적화 되었습니다 동안 평가 하 교환 HGSOC, 모든…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Searle 자금 시카고 커뮤니티 신탁 (C-076) (L.M.S.);에서 지원 시카고 생물 의학 협회에서 제공한 자금 일리노이 대학 시카고 시작 기금 (L.M.S.); 난소 암 연구 기금 동맹 (메릴랜드);에서 543296를 부여 그리고 UG3 ES029073 (J.E.B.)와 국립 센터에 발전 변환 과학, 국립 보건 연구원, 그랜트 UL1TR002003 통해 (젭 & LMS).
Materials
| 15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
| 8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
| Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
| Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
| CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
| DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
| Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
| Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
| DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
| epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
| Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
| Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
| Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
| FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
| FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
| Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
| Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
| Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
| ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
| Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
| Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
| Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
| Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
| SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
| Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
| TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
| TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |
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