Imaging calcio Dynamics in sottopopolazioni di cellule di islet pancreatica del topo

Alexander Hamilton; Elisa Vergari; Caroline Miranda; Andrei I. Tarasov

doi:10.3791/59491

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Articolo metodologico

Imaging calcio Dynamics in sottopopolazioni di cellule di islet pancreatica del topo

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DOI:

10.3791/59491

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26 novembre 2019

Alexander Hamilton¹^,² , Elisa Vergari¹ , Caroline Miranda³ , Andrei I. Tarasov¹^,⁴^,⁵

¹Oxford Centre for Diabetes, Endocrinology and Metabolism, University of Oxford, ²Lund University Diabetes Centre, Unit of Molecular Metabolism, Clinical Research Centre, Malmö University HospitalMalmö, ³Institute of Neuroscience of Physiology, Department of Physiology, Metabolic Research Unit, University of Göteborg, ⁴Oxford National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre, ⁵Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per l'imaging e la quantificazione della dinamica del calcio in popolazioni cellulari eterogenee, come le cellule delle isolotiche pancreatiche. I reporter fluorescenti vengono consegnati nello strato periferico delle cellule all'interno dell'isolotto, che viene poi immobilizzato e immagine, e viene eseguita l'analisi per cellula della dinamica dell'intensità della fluorescenza.

Abstract

Gli ormoni delle islet etiche regolano l'omeostasi della glicemia. I cambiamenti nella glicemia provocano oscillazioni di calcio citosolico nelle cellule delle issotiche pancreatiche che attivano la secrezione di tre ormoni principali: insulina (da cellule z), glucagone (cellule z) e somatostatina (cellule di zmetica). Le cellule z, che costituiscono la maggior parte delle cellule dell'isolotto e sono accoppiate elettricamente tra loro, rispondono allo stimolo del glucosio come un'unica entità. L'eccitabilità delle sottopopolazioni minori, le cellule zo-cellule e le cellule z e il 4% (10%) del roditore totale¹ (umano²⁾impartita, rispettivamente) è meno prevedibile ed è quindi di particolare interesse.

I sensori di calcio vengono consegnati nello strato periferico delle cellule all'interno dell'isolotto isolato. L'isolotto o un gruppo di isolotti viene quindi immobilizzato e immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza. La scelta della modalità di imaging è tra maggiore velocità effettiva (campo largo) e una migliore risoluzione spaziale (confocale). Convenzionalmente, la microscopia confocale a scansione laser viene utilizzata per l'imaging del tessuto, in quanto fornisce la migliore separazione del segnale tra le cellule vicine. Se il segnale contaminante proveniente dalla popolazione dominante delle cellule cellule è ridotto al minimo, è possibile utilizzare anche un sistema a campo largo, se il segnale contaminante proveniente dalla popolazione dominante delle cellule celle è ridotto al minimo.

Una volta registrate le dinamiche di calcio in risposta a stimoli specifici, i dati sono espressi in forma numerica come intensità di fluorescenza rispetto al tempo, normalizzati alla fluorescenza iniziale e corretti al basale, per eliminare gli effetti legati allo sbiancamento fluoroforo. Le variazioni della frequenza dei picchi o dell'area parziale sotto la curva (pAUC) vengono calcolate rispetto al tempo, per quantificare gli effetti osservati. pAUC è più sensibile e abbastanza robusto, mentre la frequenza di chiodare fornisce maggiori informazioni sul meccanismo di aumento del calcio.

Le sottopopolazioni di cellule minori possono essere identificate utilizzando risposte funzionali ai composti marcatori, come adrenalina e grelina, che inducono cambiamenti nel calcio citosolico in una specifica popolazione di cellule di isolotto.

Introduzione

Lo scopo del metodo è quello di immaginare cambiamenti in tempo reale nella concentrazione di calcio citosolico ([Ca^2]_cyt) nelle sottopopolazioni minori di cellule dell'isolotto pancreatico. Questo permette di scoprire i meccanismi che regolano la secrezione ormonale in queste cellule, rivelando dettagli sul discorso incrociato tra diversi tipi di cellule e, potenzialmente, introducendo una dimensione della popolazione nel quadro più ampio della segnalazione dell'isolotto.

Le isole sono costituite da diversi tipi di cellule. Oltre alle più note cellule z che secernono insulina, ci sono almeno due sottopopolazioni che s....