Imaging calcio Dynamics in sottopopolazioni di cellule di islet pancreatica del topo

Summary

Qui presentiamo un protocollo per l’imaging e la quantificazione della dinamica del calcio in popolazioni cellulari eterogenee, come le cellule delle isolotiche pancreatiche. I reporter fluorescenti vengono consegnati nello strato periferico delle cellule all’interno dell’isolotto, che viene poi immobilizzato e immagine, e viene eseguita l’analisi per cellula della dinamica dell’intensità della fluorescenza.

Abstract

Gli ormoni delle islet etiche regolano l’omeostasi della glicemia. I cambiamenti nella glicemia provocano oscillazioni di calcio citosolico nelle cellule delle issotiche pancreatiche che attivano la secrezione di tre ormoni principali: insulina (da cellule z), glucagone (cellule z) e somatostatina (cellule di zmetica). Le cellule z, che costituiscono la maggior parte delle cellule dell’isolotto e sono accoppiate elettricamente tra loro, rispondono allo stimolo del glucosio come un’unica entità. L’eccitabilità delle sottopopolazioni minori, le cellule zo-cellule e le cellule z e il 4% (10%) del roditore totale¹ (umano²⁾impartita, rispettivamente) è meno prevedibile ed è quindi di particolare interesse.

I sensori di calcio vengono consegnati nello strato periferico delle cellule all’interno dell’isolotto isolato. L’isolotto o un gruppo di isolotti viene quindi immobilizzato e immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza. La scelta della modalità di imaging è tra maggiore velocità effettiva (campo largo) e una migliore risoluzione spaziale (confocale). Convenzionalmente, la microscopia confocale a scansione laser viene utilizzata per l’imaging del tessuto, in quanto fornisce la migliore separazione del segnale tra le cellule vicine. Se il segnale contaminante proveniente dalla popolazione dominante delle cellule cellule è ridotto al minimo, è possibile utilizzare anche un sistema a campo largo, se il segnale contaminante proveniente dalla popolazione dominante delle cellule celle è ridotto al minimo.

Una volta registrate le dinamiche di calcio in risposta a stimoli specifici, i dati sono espressi in forma numerica come intensità di fluorescenza rispetto al tempo, normalizzati alla fluorescenza iniziale e corretti al basale, per eliminare gli effetti legati allo sbiancamento fluoroforo. Le variazioni della frequenza dei picchi o dell’area parziale sotto la curva (pAUC) vengono calcolate rispetto al tempo, per quantificare gli effetti osservati. pAUC è più sensibile e abbastanza robusto, mentre la frequenza di chiodare fornisce maggiori informazioni sul meccanismo di aumento del calcio.

Le sottopopolazioni di cellule minori possono essere identificate utilizzando risposte funzionali ai composti marcatori, come adrenalina e grelina, che inducono cambiamenti nel calcio citosolico in una specifica popolazione di cellule di isolotto.

Introduction

Lo scopo del metodo è quello di immaginare cambiamenti in tempo reale nella concentrazione di calcio citosolico ([Ca^2]_cyt) nelle sottopopolazioni minori di cellule dell’isolotto pancreatico. Questo permette di scoprire i meccanismi che regolano la secrezione ormonale in queste cellule, rivelando dettagli sul discorso incrociato tra diversi tipi di cellule e, potenzialmente, introducendo una dimensione della popolazione nel quadro più ampio della segnalazione dell’isolotto.

Le isole sono costituite da diversi tipi di cellule. Oltre alle più note cellule z che secernono insulina, ci sono almeno due sottopopolazioni che sono anche critiche nella regolazione della glicemia³. Le cellule di z (che costituiscono circa il 17% delle cellule di isolotto) secernono il glucagone quando la glicemia diventa troppo bassa, che segnala il rilascio di glucosio nel flusso sanguigno dai depositi nel fegato. Livelli eccessivi di glucagone (iperglucagonemia) e controllo alterato del rilascio di glucagone accompagnano (e, tecnicamente, possono contribuire alla condizione prediabetica della sensibilità all’insulina alterata⁴. Cellule (circa il 2%) somatostatina secernono in risposta all’elevazione del glucosio. Questo onnipresente ormone peptide è probabile che sia presente ad alte concentrazioni in prossimità di cellule di z e z all’interno delle isolotti, che ha un forte effetto attenuante mediato dal_recettore G su glucagone e secrezione di insulina.

Le cellule z e le cellule z condividono gran parte del meccanismo di rilevamento del glucosio con i loro parenti di lignaggio ravvicinato, le cellule z. Tutti e tre i tipi di cellule sono dotati di^canali K sensibili agli ATP, elaborati sensori metabolici⁵ che controllano il potenziale della membrana plasmatica di queste cellule eccitabili. Allo stesso tempo, la secrezione di insulina, somatostatina e glucagone è regolata in modo diverso dal glucosio. L’imaging delle dinamiche di Ca^{2 o} nelle due sottopopolazioni minori di cellule inoteche può quindi fornire una visione del discorso incrociato tra la glicemia e la produzione segretante dell’isolotto.

I primi tentativi di monitorare l’eccitabilità delle cellule z- e z utilizzando l’elettrofisiologia del morsetto sono stati presto seguiti dall’imaging di Ca^2o in singole cellule . L’identità delle cellule in questi esperimenti è stata verificata tramite una colorazione posteriore con anticorpi anti-glucagon o anti-somatostati. Questi sforzi sono stati spesso ostacolati dalla scoperta che le cellule dell’isolotto si comportano in modo molto diverso all’interno dell’isolotto e come singole cellule. Anche se le cellule z possono sembrare i principali benefattori della disposizione dell’isolotto (a causa della loro schiacciante maggioranza che sta alla base del loro forte accoppiamento elettrico), la discrepanza principale è stata, sorprendentemente, riscontrata nelle cellule a z. All’interno dell’isolotto, queste cellule sono costantemente e persistentemente attivate a basso glucosio, che è vero solo per circa il 7% delle singole cellule dello zonzoi disperso⁶. Si ritiene quindi che la segnalazione dell’attività delle cellule z- e z all’interno di isole intatte rappresenti un’approssimazione più ravvicinata delle condizioni in vivo.

In generale, ci sono due modi per riportare le dinamiche di Ca^{2 o} specificamente dalle sottopopolazioni di cellule z-cellule o che si esprimono un sensore Ca^{2 o} codificato geneticamente tramite un promotore specifico del tessuto o (ii) utilizzando composti marcatori. L’approccio precedente più elegante aggiunge il vantaggio sostanziale della vera imaging 3D e quindi dello studio della distribuzione cellulare all’interno dell’isolotto. Non può tuttavia essere applicato per materiale isolotto umano intatto. Un’altra preoccupazione potenziale è la “perdita” del promotore, in particolare quando è in atto la trasdifferenza delle cellule di z-z o la risposta delle cellule dell’alto glucosio. Quest’ultimo approccio può essere utilizzato con tessuto appena isolato, compresi campioni umani o isole coltivate. I dati, tuttavia, vengono raccolti esclusivamente dallo strato periferico delle cellule dell’isolotto, in quanto è difficile fornire la molecola di tintura/marcatore in strati più profondi senza alterare l’architettura dell’isolotto. Un vantaggio inaspettato di quest’ultimo approccio è la compatibilità con la modalità di imaging a campo largo, che consente di aumentare gli esperimenti per l’imaging simultaneo di decine o centinaia di isolotti (cioè da migliaia a decine di migliaia di cellule).

Il calcio è immaginato in vivo utilizzando sensori di famiglia GCaMP⁷ (o pericam⁸⁾geneticamente codificati, che sono varianti di proteina fluorescente verde permutata in modo circolare (GFP) fusa alla proteina calmodulin che lega il calcio e alla sua sequenza bersaglio, frammento di M13 della filiera luminosa della miosina^{cinsia 7,9}. I GCaMP hanno eccellenti rapporti segnale-rumore nella gamma delle concentrazioni nanomolare Ca² e un’alta sezione trasversale a 2 fotoni, che li rende una scelta ideale per il lavoro in vivo^10,11. L’aspetto impegnativo dell’utilizzo di sensori ricombinanti è la loro consegna nelle cellule. L’espressione eterologa richiede l’uso di un vettore virale e di una coltura ex vivo di più ore, che spesso solleva preoccupazioni per quanto riguarda la potenziale dedifferenziazione o deterioramento delle funzioni cellulari. Sebbene i modelli murini preprogettati per esprimere GCaMP risolvano questo problema, aggiungono nuove sfide aumentando notevolmente i tempi di anticipo e limitando il lavoro a un modello non umano. Un’elevata sensibilità ai cambiamenti del pH intracellulare è un altro aspetto negativo dei sensori a base di proteine¹², che è, tuttavia, meno un problema per il rilevamento dei segnali oscillatori, come Ca^{2 .}

Il vantaggio dei coloranti trappable (come il Fluo4 fluorescente verde) è che possono essere caricati in un tessuto appena isolato entro circa un’ora. Prevedibilmente, i coloranti trappable hanno rapporti segnale-rumore più bassi e (molto) una fotostabilità inferiore rispetto alle loro controparti ricombinanti. Non possiamo confermare¹³ le segnalazioni di tossicità dei coloranti trappable¹⁴, tuttavia, il sovraccarico di coloranti è un problema frequente.

I sensori red ricombinanti Ca^2o basati sulla permutazione circolare si sono evoluti rapidamente dal 2011^15,e gli sviluppi più recenti presentano una forte concorrenza per i GP¹⁶ per l’imaging dei tessuti, data una maggiore profondità di penetrazione della luce rossa. I coloranti rossi trappable disponibili in commercio possono essere utilizzati in modo affidabile per l’imaging a una singola cellula, ma, a livello tissutale, non possono competere bene con gli analoghi verdi.

C’è apparentemente pochissima scelta di tecnologia di imaging per esperimenti nel tessuto in cui la luce fuori fuoco diventa un problema critico. Il sistema confocale prevede una risoluzione accettabile a cella singola mediante la cancellazione della luce sfocata con qualsiasi obiettivo sulla NA superiore a 0,3 (per il caso di GCaMP6) o a 0,8 (colorante trappable). In senso tecnico, un microscopio confocale convenzionale può essere utilizzato per l’imaging simultaneo di [Ca^{2 ]}_cyt da centinaia (GCaMP) o decine di isolotti (tintura trappable). L’unica alternativa realistica alla modalità confocale in caso di espressione 3D del sensore nel tessuto è forse la microscopia a foglio luminoso.

Le cose sono leggermente diverse per il caso in cui il sensore è espresso nello strato periferico delle cellule all’interno del tessuto dell’isolotto. Per i sensori ricombinanti luminosi che hanno un modello di espressione intracellulare vivido, l’utilizzo di una modalità di imaging a campo largo con un obiettivo a basso NA può fornire una qualità sufficiente e premiare il ricercatore con un aumento sostanziale nel campo visivo e quindi Velocità effettiva. Un sistema a campo largo fornisce una risoluzione spaziale più scarsa, in quanto la luce fuori fuoco non viene annullata; pertanto, l’imaging del tessuto con obiettivi ad alta NA (bassa profondità di campo) è meno informativo, in quanto il segnale a singola cellula è notevolmente contaminato dalle cellule vicine. La contaminazione è molto più piccola per gli obiettivi a bassa NA (alta profondità di campo).

Esistono tuttavia attività per le quali una velocità effettiva elevata e/o una frequenza di campionamento diventano un vantaggio critico. Le cellule z- e z mostrano una sostanziale eterogeneità, che crea una domanda di campioni di dimensioni elevate per rivelare il contributo delle sottopopolazioni. L’imaging a campo largo è veloce e più sensibile, con un sistema su larga scala su larga scala su larga scala centinaia (GCaMP) o decine (Fluo4) di isolotti allo stesso rapporto segnale-rumore degli esperimenti confocali su dieci o un singolo isolotto, rispettivamente. Questa differenza di throughput rende il sistema a campo largo vantaggioso per l’imaging populationale con una risoluzione a cella singola, che può essere particolarmente critica per le piccole sottopopolazioni come quella a cellule z. Allo stesso modo, i tentativi di ricostruire l’attività elettrica da Ca^2′ spiking¹⁷ beneficerebbero della più alta frequenza di campionamento fornita da una modalità di imaging a campo largo. Allo stesso tempo, diversi problemi di nicchia come l’attività delle cellule z pancreatiche dopo la stimolazione della sottopopolazione dominante delle cellule z, richiedono l’uso di un sistema confocale. Un fattore che influenza la decisione verso la modalità confocale è la presenza di un sostanziale segnale di contaminazione proveniente dalla sottopopolazione a celle z.

Sebbene l’uso della colorazione ormonale specifica degli anticorpi per verificare l’identità delle cellule dopo gli esperimenti di imaging sia ancora un’opzione, le sottopopolazioni di cellule minori possono essere identificate utilizzando composti marcatori funzionali, come adrenalina e grelina che hanno dimostrato di stimolare selettivamente le dinamiche di Ca² o in z- 18 e di^z-18 , rispettivamente.

L’analisi dei dati di imaging time-lapse mira a fornire informazioni al di là della banale farmacologia, come l’eterogeneità della popolazione, la correlazione e l’interazione di diversi segnali. Convenzionalmente, i dati di imaging vengono analizzati come intensità rispetto al tempo e normalizzati alla fluorescenza iniziale (F/F₀). La correzione della linea di base è spesso necessaria, a causa dello sbiancamento del segnale fluoroforo o della contaminazione da cambiamenti nell’autofluorescenza o nel pH (tipicamente indotta da livelli di glucosio^12). I dati di Ca² possono essere analizzati in molti modi diversi, ma tre tendenze principali sono misurare i cambiamenti nella frequenza dei picchi, nella frazione dell’altopiano o nell’area sotto la curva, calcolata rispetto al tempo. Abbiamo trovato quest’ultimo approccio vantaggioso, soprattutto in applicazione per dati confocali fortemente sottocampionati. Il vantaggio della metrica pAUC è la sua sensibilità a entrambe le variazioni nella frequenza del segnale e nell’ampiezza, mentre calcolare la frequenza richiede un numero sostanziale di oscillazioni²¹, che è difficile da raggiungere utilizzando l’imaging convenzionale. Il fattore limitante dell’analisi pAUC è la sua elevata sensibilità alle modifiche di base.

Protocol

Tutti i metodi qui descritti sono stati sviluppati in conformità con il United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act (1986) e l’University of Oxford ethical guidelines. 1. Isolare le isole pancreatiche del topo Preparare il supporto di coltura e la soluzione di isolamento. Comporre il mezzo di coltura: RMPI1640 (vedi Tabella dei materiali), integrato con il 10% del siero di vitello fetale, 100 unità/mL di penicillina, 100 streptomicino. Distribuisci i…

Representative Results

Le isole si caricano abbastanza bene con i coloranti trappable (Figura 1A), a meno che la composizione lipidica della membrana non sia stata influenzata (ad esempio, dall’esposizione cronica agli acidi grassi). Il vettore adenovirus umano di tipo 5 (Ad5) si rivolge anche a tutte le celle dell’isolotto(Figura 1B). I problemi possono sorgere quando più di un sensore ricombinante viene espresso nella stessa cella. Inoltre, gli iso…

Discussion

Ci sono tre fasi del protocollo che sono fondamentali per il successo generale. Il successo dell’iniezione dell’enzima Liberase nel dotto biliare determina non solo il successo quantitativo della procedura di isolamento, ma influisce anche sulla qualità delle isole isolate. Pancreata non gonfiata può provocare la mancanza di alcune importanti risposte metaboliche nelle isole isolate. In secondo luogo, il caricamento del colorno/l’espressione del sensore definisce il rapporto segnale-rumore della registrazione time-laps…

Materials

40x/1.3 objective
Axiovert 200 microscope
emission
Excitation
Fetal bovine serum	Sigma-Аldrich	F7524-500ML
Fluo4	ThermoFisher (Life Technologies)	F14201
GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector	Vector Biolabs	1910
Hanks' solution	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)
Liberase	Sigma-Аldrich	5401020001
penicillin/streptomycin	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)	15140122
RPMI medium	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)	61870044
Zeiss LSM510-META confocal system	Carl Zeiss