Modellering brystkreft via en intraductal injeksjon av grobunn-uttrykker Adenovirus inn i mus bryst kjertel
Summary
Målet med denne protokollen er å beskrive en ny brystkreft modellering tilnærming basert på intraductal injeksjon av grobunn-uttrykker adenovirus inn mus melkekjertler. Denne tilnærmingen gjør at både celle-type-og organ-spesifikk manipulering av kreftfremkallende hendelser i en timelig kontrollert måte.
Abstract
Brystkreft er en heterogen sykdom, muligens på grunn av komplekse interaksjoner mellom ulike celler av opprinnelse og kreftfremkallende hendelser. Musemodeller er medvirkende til å få innsikt i disse komplekse prosessene. Selv om mange musemodeller har blitt utviklet for å studere bidrag av ulike kreftfremkallende hendelser og Opprinnelses celler til bryst tumorigenesis, er disse modellene ofte ikke celle-type eller organ spesifikk eller kan ikke indusere initiering av bryst tumorigenesis i en midlertidig kontrollert måte. Her beskriver vi en protokoll for å generere en ny type brystkreft mus modeller basert på intraductal injeksjon av grobunn-uttrykker adenovirus (ad-grobunn) i mus melkekjertler (MGs). På grunn av direkte injeksjon av ad-grobunn i melke kanaler, denne tilnærmingen er MG spesifikk, uten uønsket kreft induksjon i andre organer. Den intraductal injeksjon prosedyren kan utføres i mus på ulike stadier av deres MG utvikling (dermed tillater det Temporal kontroll av kreft induksjon, fra ~ 3-4 ukers alder). Den celle-type spesifisitet kan oppnås ved å bruke ulike celle-type-spesifikke arrangører til å drive grobunn uttrykk i adenoviral vektor. Vi viser at luminal og basal melke epitelceller (MECs) kan være tett målrettet for grobunn/loxP-basert genetisk manipulasjon via en intraductal injeksjon av ad-grobunn under kontroll av keratin 8 eller keratin 5 promoter, henholdsvis. Ved å innlemme en betinget grobunn reporter (f. eks grobunn/loxP-induserbart Rosa26-YFP reporter), viser vi at MECs målrettet av ad-grobunn, og tumorceller avledet fra dem, kan spores ved å følge reporter-positive celler etter intraductal injeksjon.
Introduction
Det overordnede målet med denne metoden er å utvikle en ny brystkreft modellering tilnærming basert på en intraductal injeksjon av ad-grobunn i musen MG. Den grobunn/loxP rekombinasjon genetiske tilnærmingen har vært mye brukt til å modellere menneskelig brystkreft hos mus. Den første generasjonen av grobunn/loxP-baserte brystkreft mus modeller er generert ved hjelp av grobunn-uttrykker transgene mus under kontroll av MEC-spesifikke arrangører (f. eks MMTV-grobunn for luminal MECs og en del av basal MECs, WAP-grobunn og Blg-grobunn for luminal forfedre og alveolære Luminal MECs, K14-grobunn for basal og en del av luminal MECs1,2,3,4,5)6, 7 andre er , 8 på alle , 9. men selv om disse grobunn transgene Lines muliggjør romlig kontroll av grobunn uttrykk (dvs. i ulike delsett av MECs), de ikke tillater timelig kontroll av grobunn uttrykk og grobunn/loxP-mediert genetisk manipulasjon. Den andre generasjonen av grobunn/loxP-baserte brystkreft mus modeller benytte induserbart grobunn aktivitet/uttrykk tilnærminger (f. eks bruk av grobunn-østrogen reseptor fusjon [CreER], som bare kan indusere grobunn/loxP rekombinasjon ved administrering av Tamoxifen), og som et resultat, disse genetiske verktøyene tillater både romlige og timelige kontroller av aktiveringen av kreftfremkallende hendelser i MECs (f. eks, K8-CreER-og K5-CreER-baserte modeller)10,11,12 . I begge generasjoner av brystkreft mus modeller, som arrangører brukes til å drive grobunn eller CreER uttrykk (f. eks Krt8, Krt5) kan også være aktiv i epitelceller i andre organer (dvs. de er celle-type-spesifikke, men ikke organ-spesifikk) eller har en lekk uttrykk i celletyper enn epitelceller (f. eks, MMTV, som har Leaky aktivitet i benmarg blodkreft celler), kan disse tilnærmingene føre til utvikling av uønsket kreft (s) i andre organ (s). Hvis disse uventede kreft forårsaker dødelighet i de berørte mus, det opprinnelige formålet med modellering brystkreft i disse musene kan være forbudt (f. eks, MMTV-grobunn-drevet kreftfremkallende hendelser kan føre til blodkreft ondartet og tidlig død av mus , på grunn av leakiness av MMTV arrangøren i blodkreft celler)4.
Her rapporterer vi en brystkreft modellering tilnærming i mus som gjør at både celle-type-og organ-spesifikk manipulering av kreftfremkallende hendelser i en timelig kontrollert måte. Denne tilnærmingen er basert på en intraductal injeksjon av ad-grobunn i musen MGs (og er dermed organ-spesifikke). Grobunn uttrykket kan styres ved hjelp av ulike MEC pasientpopulasjonen-spesifikke arrangører innebygd i adenoviral vektor (f. eks Krt8 for luminal MECs, Krt5 for basal MECs, og dermed oppnå Cell-type spesifisitet). Kreft induksjon i MGs kan være timelig styrt av en injeksjon av ad-grobunn i mus på ulike aldre, fra 3-4 ukers alder (pubertale) til voksen scenen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Suksessen til denne tilnærmingen for inducing melke svulster fra ulike subpopulasjoner av MECs stoler ikke bare på å velge riktig celle-type-spesifikke arrangører (for å drive grobunn uttrykk), men også på intraductal injeksjon prosedyren selv. Ideen bak denne tilnærmingen er at injisert ad-grobunn virus beholdes i ductal treet, som er en skjult struktur med lumen, og derfor bare MECs er eksponert for virus og er infisert av ad-grobunn. På grunn av den begrensede lumen i melke kanalene, er det viktig å bare inj…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) stipend R01 CA222560 og ved Department of Defense gjennombrudd Award W81XWH-18-1-0037.
Materials
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L | |
Riferimenti
- Wagner, K. U., et al. Cre-mediated gene deletion in the mammary gland. Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).
- Selbert, S., et al. Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland. Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).
- Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).
- van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells. eLife. 3, e03881 (2014).
- Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors. Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).
- Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).
- Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
- Liu, X., et al. Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Koren, S., et al. PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).
- Van Keymeulen, A., et al. Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity. Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).
- Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours. Nature Communications. 8, 14431 (2017).
- Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses. Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Nik-Zainal, S., et al. The life history of 21 breast cancers. Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).
- Abba, M. C., et al. A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ. Ricerca sul cancro. 75 (18), 3980-3990 (2015).
