Modellering brystkræft via en intraductal injektion af CRE-udtrykker adenovirus i mus Brystkirtlen
Summary
Målet med denne protokol er at beskrive en ny brystkræft modellering tilgang baseret på med injektion af CRE-udtrykker adenovirus i mus brystkirtler. Denne fremgangsmåde muliggør både celletype-og organspecifik manipulation af onkogene hændelser på en timeligt kontrolleret måde.
Abstract
Brystkræft er en heterogen sygdom, muligvis på grund af komplekse interaktioner mellem forskellige celler af oprindelse og onkogene begivenheder. Musemodeller er medvirkende til at få indsigt i disse komplekse processer. Selv om mange musemodeller er blevet udviklet til at studere bidrag af forskellige onkogene hændelser og celler af oprindelse til brysttumor, disse modeller er ofte ikke celle-type eller Organspecifikke eller kan ikke inducere initiering af brysttumor i en på en tidsmæssigt kontrolleret måde. Her beskriver vi en protokol til at generere en ny type brystkræft musemodeller baseret på med injektion af CRE-udtrykker adenovirus (ad-CRE) i mus brystkirtler (MGS). På grund af den direkte injektion af ad-CRE i mælkekanaler, denne fremgangsmåde er MG specifik, uden nogen uønsket kræft induktion i andre organer. Den med injektion procedure kan udføres i mus på forskellige stadier af deres mg udvikling (således, det tillader tidsmæssig kontrol af kræft induktion, startende fra ~ 3-4 uger af alder). Den celle-type specificitet kan opnås ved hjælp af forskellige celle-type-specifikke initiativtagere til at drive CRE udtryk i adenovirale vektor. Vi viser, at luminale og basal bryst epitelceller (mecs) kan være stramt målrettet til CRE/loxp-baseret genetisk manipulation via en med injektion af ad-CRE under kontrol af keratin 8 eller Keratin 5 Promoter, hhv. Ved at indarbejde en betinget CRE reporter (f. eks CRE/loxp-inducible Rosa26-yfp reporter), viser vi, at mecs målrettet af ad-CRE, og tumorceller afledt af dem, kan spores ved at følge de reporter-positive celler efter med injektion.
Introduction
Det overordnede mål for denne metode er at udvikle en ny brystkræft modellering tilgang baseret på en med injektion af ad-CRE i mus mg. Den CRE/loxP rekombinationbaserede genetiske tilgang har været meget anvendt til at modellere human brystkræft i mus. Den første generation af CRE/loxP-baserede brystkræft musemodeller genereres ved hjælp af CRE-ekspression af Transgene mus under kontrol af MEC-specifikke promotorer (f. eks., MMTV-CRE for luminale mecs og en del af basal mecs, WAP-CRE og Blg-CRE til luminale progenitorer og alveolære luminalmecs, K14-CRE til basal og en del af luminale mecs1,2,3,4,5)6, 7 , 8 , 9. selv om disse CRE-transgene linjer muliggør rumlig kontrol af CRE-ekspression (dvs. i forskellige undergrupper af mecs), tillader de dog ikke tidsmæssig kontrol af CRE-ekspression og CRE/loxp-medieret genetisk manipulation. Anden generation af CRE/loxP-baserede brystkræft musemodeller udnytter inducerbare CRE aktivitet/ekspression tilgange (f. eks brug af CRE-østrogen receptor fusion [CreER], som kun kan inducere CRE/loxP rekombination efter administration af Tamoxifen), og som følge heraf tillader disse genetiske værktøjer både rumlig og tidsmæssig kontrol af aktiveringen af onkogene hændelser i mecs (f. eks. K8-creer-og K5-creer-baserede modeller)10,11,12 . I begge generationer af brystkræft musemodeller, som initiativtagere, der anvendes til at drive CRE eller CreER udtryk (f. eks, Krt8, Krt5) kan også være aktive i epitelceller i andre organer (dvs., de er celle-type-specifikke, men ikke organ-specifikke) eller har et utætte udtryk i andre celletyper end epitelceller (f. eks. MMTV, som har utætte aktiviteter i knoglemarvs hæmatopoietiske celler), kan disse tilgange føre til udvikling af uønskede kræft (er) i andre organer. Hvis disse uventede kræftformer forårsage dødelighed i de berørte mus, det oprindelige formål med modellering brystkræft i disse mus kan være forbudt (f. eks., MMTV-CRE-drevet onkogene hændelser kan føre til hæmatopoietiske maligniteter og tidlig død af musene , på grund af udæthed af MMTV -promotoren i hæmatopoietiske celler)4.
Her rapporterer vi en brystkræft modellering tilgang i mus, der tillader både celle-type-og organ-specifikke manipulation af onkogene begivenheder i en timeligt kontrolleret måde. Denne fremgangsmåde er baseret på en intraductalinjektion af ad-CRE i muse MGs (og er således organspecifik). CRE udtryk kan styres ved hjælp af forskellige MEC subpopulation-specifikke initiativtagere indlejret i adenovirale vektor (f. eks, Krt8 for luminale mecs, Krt5 for basal mecs, således at opnå celle-type specificitet). Kræft induktion i MGs kan tidsmæssigt kontrolleres ved en injektion af ad-CRE til mus i forskellige aldre, startende fra 3-4 uger af alder (puberteten) til voksenstadiet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Succesen med denne tilgang til at inducere brysttumorer fra forskellige delpopulationer af mecs afhænger ikke kun af at vælge passende celle-type-specifikke promotorer (for at drive CRE-ekspression), men også af den med injektionsprocedure selv. Ideen bag denne fremgangsmåde er, at de injicerede ad-CRE vira bevares i duktalt træet, som er en skjult struktur med lumen, og derfor er kun mecs udsat for virus og er inficeret af ad-CRE. På grund af den begrænsede lumen plads i mælkekanalerne, er det vigtigt kun at inj…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) Grant R01 CA222560 og af Department of Defense gennembrud Award W81XWH-18-1-0037.
Materials
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L | |
Riferimenti
- Wagner, K. U., et al. Cre-mediated gene deletion in the mammary gland. Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).
- Selbert, S., et al. Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland. Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).
- Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).
- van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells. eLife. 3, e03881 (2014).
- Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors. Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).
- Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).
- Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
- Liu, X., et al. Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Koren, S., et al. PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).
- Van Keymeulen, A., et al. Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity. Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).
- Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours. Nature Communications. 8, 14431 (2017).
- Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses. Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Nik-Zainal, S., et al. The life history of 21 breast cancers. Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).
- Abba, M. C., et al. A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ. Ricerca sul cancro. 75 (18), 3980-3990 (2015).
