Modélisation du cancer du sein par injection intraductale d'adénovirus exprimant la cre dans la glande mammaire de souris
Summary
Le but de ce protocole est de décrire une nouvelle approche de modélisation de cancer du sein basée sur l’injection intraductale de l’adénovirus Cre-exprimant dans les glandes mammaires de souris. Cette approche permet à la fois la manipulation de type cellulaire et d’organe d’événements oncogènes d’une manière contrôlée temporellement.
Abstract
Le cancer du sein est une maladie hétérogène, peut-être due à des interactions complexes entre différentes cellules d’origine et des événements oncogènes. Les modèles de souris jouent un rôle déterminant dans l’obtention d’un aperçu de ces processus complexes. Bien que de nombreux modèles de souris ont été développés pour étudier les contributions de divers événements oncogènes et les cellules d’origine à la tumorigénèse du sein, ces modèles ne sont souvent pas de type cellulaire ou d’organe spécifique ou ne peut pas induire l’initiation de la tumorigenesis mammaire dans un manière contrôlée temporellement. Ici nous décrivons un protocole pour produire un nouveau type de modèles de souris de cancer du sein basés sur l’injection intraductale de cre-exprimant l’adénovirus (Ad-Cre) dans les glandes mammaires de souris (MGs). En raison de l’injection directe d’Ad-Cre dans les conduits mammaires, cette approche est spécifique MG, sans aucune induction non désirée de cancer dans d’autres organes. La procédure d’injection intraductale peut être effectuée chez les souris à différents stades de leur développement MG (donc, il permet le contrôle temporel de l’induction du cancer, à partir de 3-4 semaines d’âge). La spécificité de type cellulaire peut être atteinte en utilisant différents promoteurs de type cellulaire spécifique pour conduire l’expression Cre dans le vecteur adénoviral. Nous montrons que les cellules épithéliales mammaires luminaires et basiques (MEC) peuvent être étroitement ciblées pour la manipulation génétique à base de Cre/loxP par une injection intraductale d’Ad-Cre sous le contrôle du promoteur De kératine 8 ou Kératine 5, respectivement. En incorporant un journaliste conditionnel DeC (par exemple, Cre/loxP-inductcible Rosa26-YFP journaliste), nous montrons que les MEC ciblés par Ad-Cre, et les cellules tumorales dérivées d’eux, peuvent être tracés en suivant les cellules reporter-positives après injection intraductale.
Introduction
L’objectif global de cette méthode est de développer une nouvelle approche de modélisation du cancer du sein basée sur une injection intraductale d’Ad-Cre dans la souris MG. L’approche génétique basée sur la recombinaison Cre/loxP a été largement utilisée pour modéliser le cancer du sein humain chez la souris. La première génération de modèles de souris à base de Cre/loxP sur le cancer du sein est générée par l’utilisation de souris transgéniques exprimant cre sous le contrôle de promoteurs spécifiques au MEC (p. ex., MMTV-Cre pour les MEC suspicieux et une partie des MEC basiques, Wap-Cre et Blg-Cre pour les progéniteurs luminal et les MEC alvéolaires, K14-Cre pour les cimeaux et une partie des MECs luminal1,2,3,4,5)6, 7 Annonces , 8 Annonces , 9. Cependant, bien que ces lignes transgéniques Cre permettent le contrôle spatial de l’expression de Cre (c.-à-d., dans différents sous-ensembles de MECs), elles ne permettent pas le contrôle temporel de l’expression de Cre et de la manipulation génétique Cre/loxP-négociée. La deuxième génération de modèles de souris à base de Cancer du sein à base de Cre/loxP utilise des approches inductibles d’activité/expression cre (p. ex., l’utilisation de la fusion des récepteurs Cre-estrogen [CreER], qui ne peut induire la recombinaison Cre/loxP qu’à l’administration du tamoxifène) et en conséquence, ces outils génétiques permettent à la fois des contrôles spatiaux et temporels de l’activation d’événements oncogènes dans les MEC (p. ex., K8-CreER– et K5-CreER-modèles basés)10,11,12 . Dans les deux générations de modèles de souris de cancer du sein, comme les promoteurs utilisés pour conduire l’expression Cre ou CreER (par exemple, Krt8, Krt5) peuvent également être actifs dans les cellules épithéliales d’autres organes (c.-à-d., ils sont de type cellulaire spécifique, mais pas spécifique à l’organe) ou ont une expression qui fuit dans les types de cellules autres que les cellules épithéliales (par exemple, MMTV, qui a une activité qui fuit dans les cellules hématopoïétiques de moelle osseuse), ces approches peuvent conduire au développement de cancers indésirables (s) dans d’autres organes.s). Si ces cancers inattendus causent la létalité chez les souris touchées, le but initial de la modélisation du cancer du sein chez ces souris peut être interdit (p. ex., les événements oncogènes entraînés par MMTV-Crepeuvent entraîner des tumeurs malignes hématopoïétiques et la mort prématurée des souris. , en raison de la fuite du promoteur MMTV dans les cellules hématopoïétiques)4.
Ici nous rapportons une approche de modélisation de cancer du sein chez les souris qui permet la manipulation de type cellulaire- et d’organe-spécifique des événements oncogènes d’une manière temporellement commandée. Cette approche est basée sur une injection intraductale d’Ad-Cre dans les MG de souris (et est, par conséquent, spécifique à l’organe). L’expression de cre peut être contrôlée en utilisant différents promoteurs spécifiques à la sous-population MEC intégrés dans le vecteur adénoviral (par exemple, Krt8 pour les MEC slumineux, Krt5 pour les MEC basiques, réalisant ainsi une spécificité de type cellulaire). L’induction du cancer chez les GM peut être contrôlée temporellement par une injection d’Ad-Cre chez des souris à différents âges, à partir de 3-4 semaines d’âge (pubertal) jusqu’au stade adulte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le succès de cette approche pour induire des tumeurs mammaires de différentes sous-populations de MECs repose non seulement sur le choix des promoteurs appropriés de type cellulaire -spécifique (pour conduire l’expression de Cre) mais également sur la procédure d’injection intraductale elle-même. L’idée derrière cette approche est que les virus Injectés Ad-Cre sont conservés dans l’arbre ductal, qui est une structure cachée avec lumen, et donc, seuls les MEC sont exposés aux virus et sont infectés par Ad-Cr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par national Institutes of Health (NIH) subvention R01 CA222560 et par department of Defense Breakthrough Award W81XWH-18-1-0037.
Materials
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L | |
Riferimenti
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