Modellierung von Brustkrebs über eine intraduktive Injektion des Cre-expressingAvirus in die Maus-Mammary Drüse
Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen neuen Ansatz zur Modellierung von Brustkrebs zu beschreiben, der auf der intraduktiven Injektion von Cre-expressing adenovirus in Maus-Mammary-Drüsen basiert. Dieser Ansatz ermöglicht sowohl eine zelltyp- als auch organspezifische Manipulation onkogener Ereignisse in zeitlich kontrollierter Weise.
Abstract
Brustkrebs ist eine heterogene Krankheit, möglicherweise aufgrund komplexer Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Ursprungszellen und onkogenen Ereignissen. Mausmodelle sind entscheidend, um Einblicke in diese komplexen Prozesse zu gewinnen. Obwohl viele Mausmodelle entwickelt wurden, um Beiträge verschiedener onkogener Ereignisse und Ursprungszellen zur Brusttumorigenese zu untersuchen, sind diese Modelle oft nicht zelltyp- oder organspezifisch oder können die Initiation einer Brusttumorigenese in einem zeitlich gesteuerte Art und Weise. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Generierung einer neuen Art von Brustkrebsmausmodellen, die auf der intraduktiven Injektion des Cre-expressing adenovirus (Ad-Cre) in Maus-Mammary Drüsen (MGs) basieren. Durch die direkte Injektion von Ad-Cre in Brustkanäle ist dieser Ansatz MG-spezifisch, ohne unerwünschte Krebsinduktion in anderen Organen. Das intrauktale Injektionsverfahren kann bei Mäusen in verschiedenen Stadien ihrer MG-Entwicklung durchgeführt werden (daher ermöglicht es eine zeitliche Kontrolle der Krebsinduktion, beginnend mit einem Alter von 3-4 Wochen). Die Zelltyp-Spezifität kann erreicht werden, indem verschiedene zelltypspezifische Promotoren verwendet werden, um die Cre-Expression im adenoviralen Vektor zu fördern. Wir zeigen, dass luminale und basale Brustepithelzellen (MECs) durch eine intraduktive Injektion von Ad-Cre unter der Kontrolle des Keratin 8 bzw. Keratin 5-Promotors gezielt für die Cre/loxP-basierte genetische Manipulation eingesetzt werden können. Durch die Einbeziehung eines bedingten Cre-Reporters (z.B. Cre/loxP-inducible Rosa26-YFP-Reporter) zeigen wir, dass MECs, die von Ad-Cre ins Visier genommen werden, und von ihnen abgeleitete Tumorzellen nach der intraduktiven Injektion den Reporter-positiven Zellen folgen.
Introduction
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Entwicklung eines neuen Ansatzes zur Modellierung von Brustkrebs auf der Grundlage einer intraduktiven Injektion von Ad-Cre in die Maus MG. Der Cre/loxP-Rekombinationsansatz wurde häufig verwendet, um menschlichen Brustkrebs bei Mäusen zu modellieren. Die erste Generation von Cre/loxP-basierten Brustkrebsmausmodellen wird durch verwendung von cre-exzessienten transgenen Mäusen unter der Kontrolle von MEC-spezifischen Promotoren (z. B. MMTV-Cre für luminale MECs und einen Teil der basalen MECs, Wap-Cre und Blg-Cre für luminale Vorläufer und alveolare Leuchtdichte MECs, K14-Cre für Basal und einen Teil der luminalen MECs1,2,3,4,5)6, 7 , 8 , 9. Während diese transgenen Cre-Linien zwar die räumliche Kontrolle des Cre-Expressions (d. h. in verschiedenen Teilmengen von MECs) ermöglichen, erlauben sie jedoch keine zeitliche Kontrolle der Cre-Expression und der Cre/loxP-vermittelten genetischen Manipulation. Die zweite Generation von Cre/loxP-basierten Brustkrebs-Mausmodellen nutzt induzierbare Cre-Aktivitäts-/Expressionsansätze (z. B. Verwendung von Cre-Östrogen-Rezeptor-Fusion [CreER], die nur eine Cre/LoxP-Rekombination bei Verabreichung von Tamoxifen induzieren kann), und Daher ermöglichen diese genetischen Werkzeuge sowohl räumliche als auch zeitliche Kontrollen der Aktivierung onkogener Ereignisse in MECs (z. B. K8-CreER-und K5-CreER-basierteModelle)10,11,12 . In beiden Generationen von Brustkrebsmausmodellen können als Promotoren, die zur Antrieb von Cre- oder CreER-Expression (z. B. Krt8, Krt5) verwendet werden, auch in Epithelzellen anderer Organe aktiv sein (d. h. sie sind zelltypspezifisch, aber nicht organspezifisch) oder haben eine undichte Expression in anderen Zelltypen als Epithelzellen (z. B. MMTV, die undichte Aktivität in hämatopoetischen Knochenmarkzellen hat), können diese Ansätze zur Entwicklung unerwünschter Krebserkrankungen in anderen Organen führen. Wenn diese unerwarteten Krebsarten bei den betroffenen Mäusen eine Letalität verursachen, kann der ursprüngliche Zweck der Modellierung von Brustkrebs bei diesen Mäusen verboten sein (z. B. MMTV-Cre-getriebeneonkogene Ereignisse können zu hämatopoetischen Malignitäten und einem frühen Tod der Mäuse führen. , aufgrund der Leckage des MMTV-Promotors in hämatopoetischen Zellen)4.
Hier berichten wir über einen Ansatz zur Brustkrebsmodellierung bei Mäusen, der sowohl zelltyp- als auch organspezifische Manipulationen onkogener Ereignisse in zeitlich kontrollierter Weise ermöglicht. Dieser Ansatz basiert auf einer intraduktiven Injektion von Ad-Cre in Maus-MGs (und ist somit organspezifisch). Die Cre-Expression kann durch die Verwendung verschiedener MEC-Subpopulations-spezifischer Promotoren gesteuert werden, die in den adenoviralen Vektor eingebettet sind (z. B. Krt8 für luminale MECs, Krt5 für Basal-MECs, wodurch eine zelltypische Spezifität erreicht wird). Die Krebsinduktion in MGs kann zeitlich durch eine Injektion von Ad-Cre in Mäuse in verschiedenen Altersstufen kontrolliert werden, beginnend mit 3-4 Wochen (Pubertät) bis zum Erwachsenenstadium.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Erfolg dieses Ansatzes zur Induktion von Brusttumoren aus verschiedenen Subpopulationen von MECs hängt nicht nur von der Wahl geeigneter zelltypspezifischer Promotoren (um die Cre-Expression zu fördern), sondern auch von der intraduktiven Injektion selbst ab. Die Idee hinter diesem Ansatz ist, dass die injizierten Ad-Cre-Viren im duktalen Baum zurückgehalten werden, der eine verborgene Struktur mit Lumen ist, und daher sind nur MECs den Viren ausgesetzt und werden von Ad-Cre infiziert. Aufgrund des begrenzten Lume…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das Stipendium der National Institutes of Health (NIH) R01 CA222560 und den Breakthrough Award des Department of Defense W81XWH-18-1-0037 unterstützt.
Materials
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L | |
Riferimenti
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