Modelagem de câncer de mama através de uma injeção intraductal de CRE-expressando Adenovirus na glândula mamária do mouse
Summary
O objetivo deste protocolo é descrever uma nova abordagem de modelagem de câncer de mama baseada na injeção intraductal de adenovírus expressando CRE em glândulas mamárias de camundongo. Esta aproximação permite a manipulação Cell-Type-e órgão-específica de eventos oncogênico em uma maneira temporally controlada.
Abstract
O câncer de mama é uma doença heterogênea, possivelmente devido a interações complexas entre diferentes células de origem e eventos oncogênicos. Os modelos de mouse são fundamentais para obter insights sobre esses processos complexos. Embora muitos modelos do rato sejam desenvolvidos para estudar contribuições de vários eventos e pilhas oncogênico da origem à tumorigenese do peito, estes modelos são frequentemente não Cell-Type ou órgão específico ou não podem induzir o início do tumorigênese mamária em um forma temporalmente controlada. Aqui nós descrevemos um protocolo para gerar um novo tipo de modelos do rato do cancro da mama baseados na injeção intraductal do adenovírus CRE-expressando (AD-CRE) em glândulas mamária do rato (MGS). Devido à injeção direta de AD-CRE em dutos mamários, esta abordagem é específica de MG, sem qualquer indução de câncer indesejada em outros órgãos. O procedimento intraductal da injeção pode ser executado nos ratos em estágios diferentes de seu desenvolvimento do magnésio (assim, permite o controle temporal da indução do cancro, partindo de ~ 3-4 semanas da idade). A especificidade do tipo celular pode ser alcançada usando diferentes promotores específicos do tipo célula para impulsionar a expressão de CRE no vetor adenoviral. Nós mostramos que as pilhas epithelial mamária Luminal e basais (MECS) podem fortemente ser alvejadas para a manipulação genética CRE/loxp-baseada através de uma injeção intraductal de AD-CRE o controle do promotor da queratina 8 ou da queratina 5, respectivamente. Incorporando um repórter condicional de CRE (por exemplo, repórter de CRE/loxP-inducible Rosa26-YFP ), nós mostramos que os MECS alvejados por AD-CRE, e as pilhas do tumor derivou deles, podem ser traçados seguindo as pilhas repórter-positivas após a injeção intraductal.
Introduction
O objetivo geral deste método é desenvolver uma nova abordagem de modelagem de câncer de mama com base em uma injeção intraductal de AD-CRE no rato MG. A abordagem genética baseada em recombinação CRE/loxP tem sido amplamente utilizada para modelar o câncer de mama humano em camundongos. A primeira geração de modelos de ratos de câncer de mama baseados em CRE/loxP é gerada usando camundongos transgênicos que expressam CRE o controle de promotores específicos do MEC (por exemplo, MMTV-CRE para MECS luminais e uma porção de MECS basal, WAP-CRE e Blg-CRE para progenitores Luminal e MECs Luminal alveolares, K14-CRE para a parte basal e uma parcela de MECS Luminal1,2,3,4,5)6, 7 anos de , 8 . º , 9. Entretanto, quando estas linhas do CRE transgênicas permitirem o controle espacial da expressão de CRE (isto é, em subconjuntos diferentes dos MECS), não permitem o controle temporal da expressão de CRE e da manipulação genética de CRE/loxp-negociada. A segunda geração de modelos de mouse de câncer de mama baseados em CRE/loxp utilizam abordagens induzível de atividade/expressão CRE (por exemplo, uso de fusão do receptor de CRE-estrogênio [creer], que só pode induzir recombinação CRE/loxp após a administração de tamoxifeno), e Como resultado, essas ferramentas genéticas permitem o controle espacial e temporal da ativação de eventos oncogênicos em MECS (por exemplo, modelosbaseados em K8-creer-e K5-creer)10,11,12 . Em ambas as gerações de modelos de rato de cancro da mama, como promotores utilizados para conduzir CRE ou CreER expressão (por exemplo, Krt8, Krt5) também pode ser ativo em células epiteliais de outros órgãos (ou seja, eles são específicos do tipo de célula, mas não órgão específico) ou têm uma expressão gotejante em tipos de células que não as epiteliais (por exemplo, MMTV, que tem atividade de vazamento em células hematopoiéticas da medula óssea), essas abordagens podem levar ao desenvolvimento de câncer indesejado (s) em outros órgãos (s). Se esses cânceres inesperados causarem letalidade nos camundongos afetados, a finalidade original de modelar o câncer de mama nesses camundongos pode ser proibida (por exemplo, eventos oncogênicos conduzidos por MMTV-CREpodem levar a malignidades hematopoiéticas e morte precoce dos camundongos , devido à fuga do promotor MMTV em células hematopoiéticas)4.
Aqui nós relatamos uma aproximação de modelagem do cancro da mama nos ratos que permite a manipulação Cell-Type-e órgão-específica de eventos oncogênico em uma maneira temporally controlada. Esta aproximação é baseada em uma injeção intraductal de AD-CRE em MGs do rato (e é, assim, órgão-específico). A expressão CRE pode ser controlada usando diferentes promotores específicos da subpopulação do MEC incorporados no vetor adenoviral (por exemplo, Krt8 para MECS LUMINAIS, Krt5 para MECS basais, conseguindo assim a especificidade do tipo celular). A indução do cancro em MGs pode ser controlada temporally por uma injeção de AD-CRE em ratos em idades diferentes, partindo de 3-4 semanas da idade (pubertal) ao estágio adulto.
Protocol
Representative Results
Discussion
O sucesso desta aproximação para induzir tumores mamária das subpopulações diferentes dos MECS confia não somente em escolher o Cell-Type-específico apropriado promotores (para conduzir a expressão de CRE) mas igualmente no procedimento intraductal da injeção próprio. A idéia por trás dessa abordagem é que os vírus ad-CRE injetados são retidos na árvore ductal, que é uma estrutura oculta com lúmen, e, portanto, apenas os MECs estão expostos aos vírus e estão infectados pelo AD-CRE. Devido ao espaço…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de saúde (NIH) conceder R01 CA222560 e pelo departamento de defesa Breakthrough Award W81XWH-18-1-0037.
Materials
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L | |
Riferimenti
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