マウス乳腺へのクレオンゲンデノウイルスの誘導注射による乳癌のモデル化
Summary
このプロトコルの目的は、マウス乳腺へのクレ発現アデノウイルスの誘導注射に基づく新しい乳癌モデリングアプローチを記述することです。このアプローチにより、細胞型と臓器特異的の両方の発生イベントを一時的に制御した方法で操作できます。
Abstract
乳癌は不均一な疾患であり、起源の異なる細胞と発癌性イベントとの複雑な相互作用に起因する可能性がある。マウス モデルは、これらの複雑なプロセスに関する洞察を得るのに役立ちます。多くのマウスモデルは、乳房腫瘍形成に対する様々な発生性イベントおよび起源の細胞の寄与を研究するために開発されているが、これらのモデルはしばしば細胞型または器官特異的ではないか、または乳腺腫瘍形成の開始を誘導することができない一時的に制御された方法。ここでは、マウス乳腺(MG)へのクレ発現アデノウイルス(Ad-Cre)の誘導注射に基づいて新しいタイプの乳癌マウスモデルを生成するプロトコルについて説明する。乳管にAd-Creを直接注入するため、このアプローチはMG特異的であり、他の臓器に望ましくない癌誘導を行う必要はありません。誘導注射手順は、MG発症の異なる段階でマウスで行うことができる(したがって、癌誘導の時間的制御を可能にし、〜3〜4週間の年齢から始まる)。細胞型特異性は、異なる細胞型特異的プロモーターを使用してアデノウイルスベクター中のCre発現を駆動することによって達成することができる。我々は、明るさおよび基底乳質上皮細胞(MEC)が、それぞれケラチン8またはケラチン5プロモーターの制御下でAd-Creの誘導注射を介してCre/loxPベースの遺伝子操作を厳密に標的化できることを示した。条件付きCreレポーター(例えば、Cre/loxP誘導性Rosa26-YFPレポーター)を組み込むことにより、Ad-Creを標的とするMECおよびそれらに由来する腫瘍細胞を、誘導注射後のレポーター陽性細胞に従って追跡できることを示す。
Introduction
この方法の全体的な目標は、マウスMGへのAd-Creの誘導注射に基づく新しい乳癌モデリングアプローチを開発することです。Cre/loxP組み換えベースの遺伝的アプローチは、マウスのヒト乳癌のモデル化に広く使用されている。Cre/loxPベースの乳癌マウスモデルの第1世代は、MEC特異的プロモーターの制御下でCre発現トランスジェニックマウスを使用して生成される(例えば、明るさMECおよび基底MECの一部のMMTV-Creおよび基底MECの一部、Wap-Creおよび明面前駆体および肺胞の明面MECのためのBlg-Cre、基底および発光MECの一部のためのK14-Cre1、2、3、4、5)6、 7,8,9.しかし、これらのCreトランスジェニックラインは、Cre発現の空間制御を可能にする一方で(すなわち、MECの異なるサブセットで)、Cre発現およびCre/loxP媒介遺伝子操作の時間的制御を可能にしない。Cre/loxPベースの乳癌マウスモデルの第2世代は、誘導性Cre活性/発現アプローチ(例えば、タモキシフェンの投与時にのみCre/loxP組換えを誘導することができるCre-エストロゲン受容体融合[CreER]の使用)を利用し、その結果、これらの遺伝的ツールは、MEC(例えば、K8-CreER-およびK5-CreERベースのモデル)10、11、12の発動の空間的および時間的制御の両方を可能にする。 .乳癌マウスモデルの両方の世代において、CreまたはCreER発現を駆動するために使用されるプロモーターとして(例えば、Krt8、Krt5)も他の器官の上皮細胞において活性であり、それらは細胞型特異的であるが、臓器特異的ではない)または上皮細胞以外の細胞型(例えば、骨髄血素細胞に漏出活性を有するMMTV)において漏出発現を有し、これらのアプローチは他の臓器における望ましくない癌の発症につながる可能性がある。これらの予期しない癌が罹患したマウスで致死性を引き起こす場合、これらのマウスにおける乳癌のモデル化の本来の目的は禁止されるかもしれない(例えば、MMTV-Cre-駆動発癌事象は、造形悪性腫瘍およびマウスの早期死につながる可能性がある)、血化細胞におけるMMTVプロモーターの漏洩による)4.
ここでは、細胞型と臓器特異的な発癌事象の両方を時間的に制御された方法で可能にするマウスにおける乳癌モデリングアプローチを報告する。このアプローチは、マウスMGへのAd-Creの誘導注入に基づいています(したがって、臓器特異的です)。Cre発現は、アデノウイルスベクターに埋め込まれた異なるMEC亜集団特異的プロモーターを用いて制御することができる(例えば、発光MECの場合はKrt8、基底MECのKrt5、したがって細胞型特異性を達成する)。 MGの癌誘導は、3〜4週齢(思春期)から成人期まで、異なる年齢のマウスにAd-Creを注射することによって一時的に制御することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
MECの異なる亜集団から乳腺腫瘍を誘導するためのこのアプローチの成功は、適切な細胞型特異的プロモーター(Cre発現を駆動する)を選択するだけでなく、誘導注射手順自体にも依存する。このアプローチの背後にある考え方は、注入されたAd-Creウイルスは、内膜を持つ隠された構造であるダクトツリーに保持され、したがって、MECだけがウイルスにさらされ、Ad-Creによって感染しているとい?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所(NIH)助成金R01 CA222560と国防総省ブレークスルー賞W81XWH-18-1-0037によってサポートされました。
Materials
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L | |
Riferimenti
- Wagner, K. U., et al. Cre-mediated gene deletion in the mammary gland. Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).
- Selbert, S., et al. Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland. Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).
- Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).
- van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells. eLife. 3, e03881 (2014).
- Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors. Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).
- Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).
- Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
- Liu, X., et al. Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Koren, S., et al. PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).
- Van Keymeulen, A., et al. Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity. Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).
- Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours. Nature Communications. 8, 14431 (2017).
- Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses. Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Nik-Zainal, S., et al. The life history of 21 breast cancers. Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).
- Abba, M. C., et al. A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ. Ricerca sul cancro. 75 (18), 3980-3990 (2015).
