-Omics 분석 및 1 차 적인 세포 배양을 위한 박쥐의 조직 수집
Summary
이것은 야생에서 잡힌 박쥐의 게놈, 전사체 및 단백질 분석을위한 최적의 조직 준비를위한 프로토콜입니다. 그것은 박쥐 포획 및 해부, 조직 보존 및 박쥐 조직의 세포 배양을위한 프로토콜을 포함한다.
Abstract
고처리량 시퀀싱 기술이 발전함에 따라 고품질 조직 획득 및 보존을 위한 표준화된 방법을 통해 이러한 방법을 비모델 유기체로 확장할 수 있습니다. 박쥐에서 조직 수집을 최적화하는 일련의 프로토콜은 일련의 고처리량 시퀀싱 접근법을 위해 개발되었습니다. 여기에 설명된 것은 박쥐 포획을 위한 프로토콜, 각 박쥐에 대해 수집할 원하는 인구 통계, 조직 수집 중 박쥐의 스트레스를 최소화하기 위한 최적화된 방법입니다. 구체적으로 설명된 것은 (i) 고분자량 게놈 분석을 위한 DNA, (ii) 조직 특이적 전사체에 대한 RNA 및 (iii) 단백질-수준 분석을 위한 단백질을 얻기 위해 조직을 수집하고 치료하는 방법이다. 마지막으로, 또한 날개 클립에서 실행 가능한 기본 세포 배양을 만들어 치명적인 샘플링을 피하는 방법입니다. 이 방법의 중앙 동기는 각 박쥐에 대한 잠재적 인 분자 및 형태 학적 데이터의 양을 극대화하고 새로운 방법이 미래에 개발로 자신의 가치를 유지하기 위해 조직을 보존하는 최적의 방법을 제안하는 것입니다. 이 표준화는 전 세계 여러 과학 당사자가 다른 분류학의 순서를 주도하고있는 염색체 수준의 오류없는 게놈을 서열화하는 이니셔티브가 등장함에 따라 특히 중요해졌습니다. 그룹. 본 명세서에 설명된 프로토콜은 Bat1K에 대한 이상적인 조직 수집 및 조직 보존 방법을 정의하며, 이는 모든 종의 박쥐의 게놈을 시퀀싱하는 컨소시엄이다.
Introduction
고처리량 시퀀싱(HTS) 방법은 효율성이 급격히 향상되고 비용이 감소했으며, 이제 이러한 접근 방식을 수백 또는 수천 개의 샘플로 확장할 수 있습니다. 이러한 기술의 적용에 의해 얻은 통찰력은 생물 의학에서 진화와 생태에 이르기까지 여러 과학 분야에 걸쳐 엄청난 영향을 미칩니다1,2,3. 그러나 많은 HTS 응용 분야는 살아있는 공급원의 고품질 핵산에 비판적으로 의존합니다. 이러한 제한은 긴 읽기 분자4에기초한 3세대 염기서열 분석의 발달로 점점 더 문제가 될 가능성이 높다. 이러한 이유로, 물질의 유용성을 극대화하고 필요한 개인의 수를 감소 실험실 외부 야생 유기체에서 신선한 조직 샘플을 수집하기위한 모범 사례를 수립에 노력을 집중할 필요가있다 수집.
Bat1K는 모든 종의 박쥐의 게놈을 염색체 수준 어셈블리5로서열화하는 지속적인 이니셔티브를 가진 과학자들의 국제 컨소시엄입니다. 박쥐는 포유류 다양성의 20%를 나타내며 노화, 질병 생태학, 감각 생물학 및 신진 대사를 이해하는 데 영향을 미치는 뛰어난 적응을 가지고있습니다5,6. 많은 박쥐는 또한 인간 착취7 때문에 위협또는 멸종 위기에 처해 있거나 병원체8,9및게놈 수준 염기서열 분석으로 인해 급속히 감소하고 있으며 이러한 종의 보존을 위해 매우 중요합니다. Bat1K는 현재 모든 박쥐 종의 게놈을 서열화하는 것을 목표로하지만, 고품질 의 게놈 염기서열 분석용 조직 샘플 수집의 표준화는 생물 생물학자 커뮤니티 전반에 걸쳐 주요 과제로 남아 있습니다. 게놈 데이터 이외에, 박쥐 적응의 다양성의 기능적인 이해는 조직 특정 전사체 및 단백질 분석을 요구합니다, 수시로 개별적인 수집 프로토콜을 요구합니다. 또한, 모든 분류학 그룹과 마찬가지로 최적의 조직 수집 및 보존은 -omics 분석을 위한 최고 품질의 데이터를 얻기 위해 필수적이지만, 급변하는 기술로 인해 모범 사례를 전달하는 것은 종종 어렵습니다. 여러 연구 팀이 독립적으로 일하고 있습니다.
많은 박쥐 종은 희귀하거나 위협주어진 박쥐 -omics 연구에 대한 모범 사례를 채택 할 필요성은 특히 시급하다. 설치류와 슈루와 같은 다른 작은 포유동물과는 달리 박쥐는 수명이 길며, 뛰어난 DNA 복구 메커니즘10과 느린 번식11에기인하며, 대부분의 종은 1년에 한 마리 또는 (몇 가지 경우) 2마리를 낳습니다. 이러한 이유로, 박쥐 인구는 방해에서 복구 속도가 느릴 수 있습니다., 야생에서 많은 개인을 수집 하는 것이 좋습니다 도 실현. 즉, 단일 시편에 대한 최대 데이터 양을 얻기 위해 프로토콜을 최적화해야 하므로 샘플링 노력을 불필요하게 복제할 필요가 줄어듭니다.
여기서, 이 프로토콜은 게놈 및 전사체 염기서열 분석 및 단백질 분석을 위한 박쥐 조직의 수집 및 샘플링을 위한 표준화된 방법에 특히 초점을 맞추고 있다. 최우선 과제는 박쥐 조직이 윤리적이고 책임감 있게 수집되도록 하는 것이며, 수집 허가 과정, 조직 수출, 동물에 대한 스트레스 최소화, 장기 보관 조건에 이르기까지 다양합니다. 수집된 다양한 재료의 유용성을 미래지향적으로 하기 위해 정교한 해부가 개발되었습니다. 이 원고는 인구에 미치는 영향을 최소화하고 과학적 가치를 극대화하기위한 인도적 인 방법으로 박쥐를 수집하는 단계별 가이드를 제공합니다. 이 프로토콜의 초점은 박쥐에 사용하기 위한 것이지만, 많은 단계는 다른 척추동물 과세, 특히 포유류와 관련이 있습니다.
티슈 컬렉션 개요
저장 온도 및 보존제 선택을 포함한 조직 수집 절차는 계획된 모든 다운스트림 분석의 특성에 따라 결정됩니다. 그러나, 가능한 경우, 조직은 특정 분석이 계획되지 않은 경우에도 미래의 유틸리티를 극대화하기 위해 다양한 방법으로 수집되는 것이 좋습니다. 일반적으로 조직은 핵산 (DNA 및 RNA) 또는 단백질의 후속 분석을 위해 수집되고 보존됩니다. 이러한 각 응용 분야에 대해, 조직은 액체 질소 (LN2)에서 직접 플래시 동결에 의해 최적으로 보존 될 수있다. 그러나 LN2에 즉각적인 침수가 항상 가능한 것은 아닙니다. 기술이 발전함에 따라 DNA와 RNA를 주변 온도에서 저장하는 특수 바이알과 같은 리소스가 더욱 쉽게 이용 가능해지고 있습니다. 이 프로토콜에서 이러한 모든 자료를 검증하지는 않았지만, 다른 연구자들은 여기에 존재하는 것과 비교하여 새로운 물질의 성능을 비교적 분석할 것을 권장합니다. 우리는 LN2에 액세스 할 수없는 상황에서 다른 응용 프로그램에 대한 조직을 이상적으로 보존하는 방법을 제공합니다, 예를 들어, LN2 전송은 아마존에서 작은 비행기를 통해 사이트 액세스로 인해 불가능합니다. 또한, 우리는 살아있는 세포가 성장하고 전파 될 수있는 조직을 수집하는 방법을 제공합니다. 아래에서는 이러한 각 목적에 대한 자료 수집에 대한 주요 고려 사항을 간략하게 설명하고 수집 방법에 대한 개요는 표 1에요약되어 있습니다.
DNA를 위한 조직
수집된 모든 수확 된 조직에 대해, 저장 매체는 표준 또는 높은 분자량 (HMW) DNA 추출에 사용될 수 있는지 여부를 결정합니다. HMW는 긴 읽기 시퀀싱에 필요하며 현재 염색체 수준 게놈 어셈블리 또는 “백금 표준” 게놈을 생성하는 데 필요합니다. 낮은 분자량 (LMW) DNA는 플래시 냉동에서 추출 할 수 있습니다, AllProtect (이제부터 “조직 안정화 용액”이라고함), 또는 RNAlater (이제부터 “RNA 안정화 용액”)-보존 된 샘플 (플래시 냉동 샘플은 최적 남아 있지만) ). 표준 실험실 방법(예를 들어, 실리카 겔 막 스핀 컬럼, 페놀-클로로포름)에 의해 단리된 DNA는 여전히 최대 ~20 킬로베이스(kb)의 DNA 단편을 산출할 수 있다. 따라서, 충분한 수율이 제공되면, 이러한 형태의 단리된 DNA는 삽입 크기가 종종 ~500 염기 쌍(bp)이고, ~100 bp의 짧은 서열 판독이 생성되는 단일 삽입 크기 라이브러리 준비에 사용될 수 있다12. 이 DNA는 전체 길이 염색체 데이터가 필요하지 않은 “재열화” 프로젝트 또는 연구에 특히 유용합니다. HMW DNA(10-150 kb)는 수확 후 LN2에서 급속히 증멸되고 추출될 때까지 최대 -80°C에서 유지되는 조직을 사용하여 안정적으로 얻을 수 있습니다.
낮은 분자량 또는 단편화된 DNA는 종종 PCR을 통한 유전자 증폭 및 짧은 읽기 시퀀싱13을포함한 표적 접근법에 충분합니다. 하나 또는 몇 개의 유전자만을 대상으로 하는 LMW DNA를 이용한 PCR 기반 조사는 박쥐 감각 생물학6,14,생리학15,계통유전학의 적응 및 분자 진화에 매우 유익했습니다. 5,16, 보존17,18. 낮은 분자량 및 단편화된 DNA의 성공적인 표적 서열 재캡처는 또한 박쥐19를포함하는 수많은 척추동물 단을 위해 입증되었습니다. 이러한 방법은 종종 박쥐에 비용 효과적이고 최소 침습, 대변 샘플및 비 치명적인 조직 샘플링으로 볼 면봉 또는 날개 생검 펀치는 또한 낮은 분자량 분석20에대한 DNA를 얻는 일반적인방법입니다, 21.
그러나 품질은 샘플이 저장되는 미디어유형(22)에크게 좌우됩니다. 볼 면봉과 생검 펀치의 체계적이고 정량적인 비교 후, 날개 생검 펀치는 DNA의 일관되게 높은 수준을 산출하기 위하여 보였고 수집 도중 박쥐에 더 적은 스트레스가 있었습니다22. 이러한 비교는 또한 날개 펀치가 지표 실리카(즉, 수분이 관찰될 때 색이 변하는 실리카 젤 비드로 만들어진 건조제의 일종)에서 날개 펀치를 보존했을 때 가장 좋은 결과를 얻었다는 것을 보여주었다. 에탄올 또는 DMSO22; 비록, 조직 안정화 용액을 포함하는 다른 저장 매체는 검토되지 않았다. 날개 펀치는 또한 Kacprzyk 외23 및 아래에 기재된 바와 같이 배양에서 섬유아세포 세포를 성장시키는데 사용될 수 있다(섹션 6 참조). 이러한 방법의 경우 날개 또는 우로파파그뮴을 부드럽게 확장해야 하며, 깨끗한 생검 펀치(일반적으로 직경 3mm)를 사용하여 샘플을 수득해야 합니다. 이 접근은 대부분의 경우에24에서주 안에 치유하는 흉터와 함께, 지속적인 손상을 일으키는 원인이 되기 위하여 나타납니다.
HMW DNA(10-150 kb)는 더 까다롭고 현재 수확 후 LN2에서 급속히 증멸되고 추출될 때까지 최대 -80°C에서 유지되는 조직을 사용하여 안정적으로 수득됩니다. HMW DNA (10-150 kb)는 긴 읽기 DNA 염기서열 분석및 따라서 드 노보 게놈 어셈블리에 매우 중요합니다. 실제로 대부분의 상용 키트는 표준 HMW DNA를 분리하는 데 사용할 수 있지만, 생성 된 분자 크기는 종종 3 세대 염기서열 분석 기술의 요구 사항을 충족시키지 못합니다 [예를 들어, 태평양 생물 과학 (PacBio)과 같은 회사에서 출시 한 키트, 옥스포드 나노 포어 기술, 및 10 x 유전체학, 또는 바이오 나노 유전체학 또는 도브 테일 유전체학에 의해 제공되는 조립 방법을 통해]. 이와 같이, “울트라 HMW” DNA (>150 kb)에 대 한 새로운 수요가 있다. 박쥐에서 울트라 HMW DNA를 얻을 때, 간, 뇌, 또는 근육의 신선한 샘플은 모두 적합하지만, 이들은 저장 버퍼 또는 냉동 보호제없이 LN2에서 즉시 플래시 냉동해야합니다. 이러한 단계에 대한 전체 설명은 이 백서의 범위를 벗어나지만다른 25에서사용할 수 있습니다.
RNA를 위한 조직
RNA는 DNA 보다는 보다 적게 안정적 인 단 하나 좌초분자입니다. RNA의 많은 양식이 있더라도, -omics 분석은 mRNA (메신저 RNA) 및 작은 RNA (예를 들면, microRNAs)에 집중하는 경향이 있습니다. 전사 에 이어, mRNA는 인트론을 포함하지 않고 유전자/게놈의 코딩 부분을 나타내는 성숙한 전사체를 형성하도록 접합된다. 코딩 유전자는 게놈 크기 (1%-2)의 작은 분율을 차지합니다, 표적으로 하는 mRNA는 유전자를 위한 서열 데이터를 얻기의 비용 효과적인 수단을 만들기. MicroRNAs는 단백질로 mRNA의 번역 과정을 통제하는 RNA의 부류이고 이렇게 중요한 규정 효력자입니다. RNA 전사체는 전사체의 일부로서 개별적으로, 또는 보다 일반적으로-오믹스 분석26,27,28,29,30; 즉, 주어진 샘플에 존재하는 모든 RNA 전사체의 합계이다.
시퀀싱은 여러 가지 방법(즉, 짧은 읽기 RNA-seq 또는 긴 읽기 전체 이소폼 Seq를 통해)에 따라 수행될 수 있으므로 RNA 풍부도 및 이소폼 사용 모두를 분석할 수 있습니다. mRNA 전사체의 양과 다양성은 세포와 조직 사이에서 변화하기 때문에, RNA 순서는 견본에 걸쳐 유전자 발현 그리고 규정을 공부하고 비교하는 것을 가능하게 합니다. 이러한 방법이 점점 더 생물학적으로 유익해지고 있기 때문에 작은 RNA 및 전체 이소폼 시퀀싱시퀀싱에 대한 관심이 증가하고 있습니다. RNA의 상이한 클래스를 서열화하는 조직 샘플의 제조는 이 원고에 제시된 것과 동일한 방식으로 수행될 수 있으며,31,32의후속 추출 방법만을 갖는다. 마지막으로, 전사체는 단백질 코딩 게놈의 높은 커버리지 서브세트를 제공하기 때문에, 조립된 데이터 세트는 게놈 조립 및 주석에 유용할 수 있으며, 다양한 조직에 걸쳐 RNA-seq 데이터를 수집하여 중요한 구성 요소로 만드는 데 유용할 수 있습니다. Bat1K 이니셔티브.
DNA와 는 대조적으로, RNA는 화학적으로 불안정하고 또한 RNA 기지를 둔 바이러스에 대하여 방어 전략으로 조직에서 유비쿼터스로 존재하는 RNase 효소에 의해 표적으로 합니다. 이러한 이유로, 세포와 조직에 있는 RNA 분획은 샘플링 및/또는 안락사의 점 직후에 저하하기 시작합니다. 따라서 RNA를 보존하려면 분해를 방지하는 단계가 필요합니다. 이것은 전형적으로 조직에 자연적으로 존재하는 RNases를 비활성화하기 위하여 RNA 안정화 해결책과 같은 안정화 에이전트에 있는 4°C에서 갓 수집한 조직을 보존하고, 더 긴 저장을 위해 동결하는 관련시킵니다. 바람직한 대안으로서, 조직은 LN2에서 플래즌 냉동될 수 있다; 위에서 언급했듯이, LN2를 현장으로 운반하고 조직 해동을 방지하기 위해 수준을 유지하는 것은 물류적으로 어려울 수 있습니다.
단백질 조직
단백질 조성 및 상대적 풍부도는 RNA에 대해 논의된 것과 유사한 방식으로 세포 및 조직 간에 다양합니다. 그러나, 단백질은 RNA 보다는 평균적으로 더 안정적입니다. 프로테오믹스를 이용한 단백질 식별은 전형적으로 전체, 단백질 서열이 아닌 분수와 일치하지만, 조직 전반에 걸쳐 발현에 대한 정보를 제공하고 존재하는 병원체를 특성화할 수 있다. 많은 단백질 서열이 포유류에 걸쳐 보존되기 때문에, 프로테오믹스를 위한 박쥐 견본은 쉽게 수집 도중 멸균 프로토콜 (예를 들면, 장갑, 집게)를 요구하는 보존된 인간 단백질로 오염될 수 있습니다. LN2의 플래시 동결은 단백질의 분해를 방지하는 가장 좋은 방법이지만, 드라이 아이스, -20 °C 냉동고, 심지어 얼음은 다른 방법이 없는 경우에 적합합니다. 온도가 증가함에 따라 차동 단백질 분해의 위험도 증가합니다. 조직 안정화 용액과 같은 안정화 제는 실온에서 조직의 단백질 분획을 보존하는 데 효과적이며 플래시 동결이 가능하지 않을 때 단기 보존 (최대 1 주)에 적합합니다.
주어진 조직의 효소 프로파일은 그 안에 있는 단백질의 보존에 직접적인 영향을 미칩니다. 근육과 같은 낮은 효소 활동을 가진 조직은 가정용 냉동고의 더 높은 온도에서도 단백질 프로파일을 보존 할 수 있습니다. 대조적으로, 간 조직은 효소 반응성이고, 그것의 단백질은 준비 도중 저하의 더 높은 확률이 있습니다. 포르말린 고정 파라핀 임베디드 (FFPE) 샘플에서 인간 단백질 프로파일을 얻기위한 프로토콜의 증가는 조직의 파라 포름 알데히드 고정이 수집시 동결 시 저비용 단백질 보존에 대한 약속을 보유하고 있음을 시사한다. 실현 가능한33,34. 보존 시간 및 상태에 크게 의존하지만, 단백질은 포르말린 고정, 에탄올 보존 박쥐 표본35에서면역 히스토화학을 통해 확인되었습니다. 이 접근법은 프로테오믹스 수준의 샘플링으로 확장할 수 없지만, 플래시 동결을 사용할 수 없고 다른 안정화 제가 너무 비용이 많이 들 때 포르말린 고정 박쥐 조직이 단백질 프로필을 생성할 수 있는 가능성을 강조합니다.
세포 배양을 위한 조직
샘플링 조직 및 플래시 동결은 사용할 재료의 한정된 양을 제공하고, 재료가 사용되면, 그것은 더 이상 사용할 수 없습니다. 또는, 세포 배양은 미래 연구를 위해 즉시 사용되거나 보존될 수 있는 살아있는 세포를 제공합니다. 배양은 또한 조직 견본이 작을 때 수율을 증가시키기 위하여 세포의 확장을 촉진합니다. 비 치명적인 샘플링이 필수적이며 따라서 보존에 대한 광범위한 의미가있는 희귀 종을 실험하는 것과 같이 조직 수집이 제한된 경우에 특히 유용합니다. 기재된 프로토콜은 날개 막 조직의 비치명적인 샘플링을 통해 세포 배양이 가능하지만 다중 조직유형인 36,37로배양이 가능하다. 여기에 제공된 프로토콜은 부착 셀을 선택합니다. 사용된 근원 조직 및 성장 매체의 조합은 이 프로토콜을 섬유아세포를 선택하고 성장시키는 데 적합하지만, 원하는 경우, 다른 세포 유형을 선택하기 위해 대체 프로토콜을 사용할 수 있다. Bat1K 프로젝트의 맥락에서, 희귀하고 위협적인 종의 경우, 날개 막의 비 치명적인 샘플링과 배양을 통한 샘플의 확장이 채택된 여러 기술에 필요한 DNA의 양을 생성하는 데 필수적이라고 예측됩니다5 .
박쥐 포획
박쥐를 다루는 모든 사람들은 박쥐 유능한 연구원에 의해 훈련되고 일련의 사전 노출 주사로 광견병 예방 접종을받아야합니다. 물린 경우, 노출 후 주사의 추가 시리즈는 여전히 필요. 박쥐를 캡처하는 표준 방법은 미스트 그물(그림 1)및 하프 트랩(그림 2)을포함한다. 미스트 네트는 박쥐 고민을 최소화하기 위해 가장 많은 주의를 기울여야 하기 때문에 활동이 적당하여 활동이 적당하지 않는 지역에 가장 많이 사용됩니다. 작은 박쥐는 특히 취약하며 빨리 하지 않으면 스트레스로 죽을 수 있습니다. 빈번한 순 검사는 박쥐 부상과 사망률뿐만 아니라 안개 그물의 손상을 최소화합니다. 적절한 조직 수집은 조직이 신선해야하기 때문에이 세부 사항은 중요하며, 박쥐의 안개 그물에 대한 부적절한주의는 연구원이 샘플을 적절하게 처리하기 전에 불필요한 사망 또는 조기 사망으로 이어질 수 있습니다. 여러 박쥐가 최소한의 고민으로 하프 트랩에 휴식을 취할 수 있기 때문에,이 방법은 동굴이나 큰 닭 근처와 같은 박쥐 활동이 높은 지역에 이상적입니다. 적절한 박쥐 캡처 및 형태 학적 및 인구 통계 적 정보의 수집을위한 데이터 처리에 대한 자세한 지침은 보충 방법에서 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고에서 논의된 프로토콜은 박쥐의 다양한 고처리량 분자 분석을 위한 최상의 샘플링 사례를 설명합니다. 모든 성공적인 -omics 연구는 고품질 조직을 필요로하지만, 샘플링 박쥐 조직뿐만 아니라 다른 비 모델 유기체, 종종 제어 실험실 설정과 동일한 표준으로 설정할 수없는 필드 조건에서 발생합니다. 샘플링은 전기 및 냉동고에 대한 제한된 액세스를 포함하여 최소한의 리소스로 원격 위치…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
센트로 데 에코로지아 y 바이오다이버시다드 CEBIO, 에리카 팔리자, 밀루스카 산체스, 호르헤 카레라, 에드가 렌기포 바스케스, 해롤드 포로카레로 자리아, 호르헤 루이스 레보, 하이메 페체코 카스티요, 카를로스 텔로, 패니 코넬레호, 패니 페르네즈 에게 감사드립니다. 페루에서 수집 할 수 있습니다. 또한 도미니카 공화국에서 조직 수집을 가능하게 해준 그루포 자라과와 욜란다 레온의 모든 회원과 베르날 로드리게스 에르난데스, 베르날 마타리타, 코스타리카의 라 셀바 생물 연구 센터의 모든 분들께 감사드립니다. 샘플링이 가능합니다. 우리는 세포 배양 생성을위한 필로스토무스 변색 박쥐에서 날개 펀치의 액세스 및 샘플 수집에 대한 엘라 Lattenkamp & Lutz Wiegrebe 감사합니다. 필로스토무스 변색 박쥐는 뮌헨의 루드비히 막시밀리안 대학의 학과 생물학 II의 번식 식민지에서 유래. 박쥐를 유지하고 번식하는 승인은 뮌헨 지역 수의학 사무소에 의해 발행되었다. LMD, SJR, KTJD 및 LRY는 NSF-DEB 1442142의 자금을 지원받았습니다. LMD는 NSF-DEB 1838273에 의해 투자되었다. LRY는 NSF-PRFB 1812035에 의해 투자되었다. SCV와 PD는 막스 플랑크 연구 그룹 상과 인간 국경 과학 프로그램 (HFSP) 연구 보조금 (RGP0058 /2016)에 의해 투자되었다. SJR, JHTP, KTJD는 유럽 연구위원회 (ERC 시작 교부금 310482 [EVOGENO])에 의해 투자되었다, ECT는 유럽 연구위원회 보조금에 의해 투자되었다 (ERC-2012-StG311000).
Materials
| 1.5 mL Eppendorf Safelock tubes | Fischer Scientific | 10509691 | 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62,554,002 | 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 2 mL cryovials | Thomas Scientific | 1154P75 | cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen |
| 3-mm biopsy punch | Medline | MIL3332 | wing biopsy punch for cell culture |
| 6 well plate | Greiner | 83,392 | Culture vessle |
| Allprotect Tissue Reagent | Qiagen | 76405 | for fecal samples; tissue stabilizing solution |
| Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber | Bio-Rad | 145-0011 | Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad |
| collagenase IV | Stemcell Technologies | 7909 | For dissociation of primary cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | Prevents crystalization of water during freezing of the cells. |
| DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 12491-015 | culture media |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190169 | Balanced salt solution used for washing cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Fischer Scientific | 10270106 | Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells |
| Gentamycin sulfate salt | Sigma Aldrich | G1264-250MG | Antibiotic for culture media |
| Nalgene Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0050 | Freezing container which provides 1°C/min cooling rate |
| PARAFILM | Sigma | P7793 | Wrapping tubes etc for sealing |
| Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x | Invitrogen | 15140130 | Antibiotic for culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water |
| RNAlater | Thermo Fisher | AM7021 | RNA stabilizing solution |
| RNAse away | Genetech | 83931-250mL | breaks down enzymes that lead to RNA degradation |
| Silica gel | Fisher Scientific | 7631-86-9 | dessicant agent |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Automated cell counter |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | Cell stain used to assess cell viability |
| trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 | For dissociation of cells during splitting |
Riferimenti
- Jiao, W. B., Schneeberger, K. The impact of third generation genomic technologies on plant genome assembly. Current Opinion in Plant Biology. 36, 64-70 (2017).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Naquin, D., Thermes, C. The third revolution in sequencing technology. Trends in Genetics. 34 (9), 666-681 (2018).
- Lee, H., et al. Third-generation sequencing and the future of genomics. bioRxiv. , 048603 (2016).
- Mayjonade, B., et al. Extraction of high-molecular-weight genomic DNA for long-read sequencing of single molecules. BioTechniques. 62 (1), xv (2017).
- Teeling, E., et al. Bat biology, genomes, and the Bat1K project: To generate chromosome-level genomes for all living bat species. Annual Review of Animal Biosciences. 6 (12), 1-24 (2018).
- Jones, G., Teeling, E. C., Rossiter, S. J. From the ultrasonic to the infrared: molecular evolution and the sensory biology of bats. Frontiers in Physiology. 4 (117), 1-16 (2013).
- Vincenot, C. E., Florens, F. B. V., Kingston, T. Can we protect island flying foxes. Science. 355 (6332), 1368-1370 (2017).
- Blehert, D. S., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen?. Science. 323 (5911), 227 (2009).
- Foley, J., Clifford, D., Castle, K., Cryan, P., Ostfeld, R. S. Investigating and managing the rapid emergence of White Nose Syndrome, a novel, fatal, infectious disease of hibernating bats. Conservation Biology. 25 (2), 223-231 (2011).
- Foley, N. M., et al. Growing old, yet staying young: The role of telomeres in bats’ exceptional longevity. Science Advances. 4, (2018).
- Dammann, P. Slow aging in mammals—Lessons from African mole-rats and bats. Seminars in Cell and Developmental Biology. 70, 154-163 (2017).
- Tsagkogeorga, G., Parker, J., Stupka, E., Cotton, J. A., Rossiter, S. J. Phylogenomic analyses elucidate the evolutionary relationships of bats. Current Biology. 23 (22), 2262-2267 (2013).
- Rohland, N., Reich, D. C. o. s. t. -. e. f. f. e. c. t. i. v. e. high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Yohe, L. R., et al. Trpc2 pseudogenization dynamics in bats reveal ancestral vomeronasal signaling, then pervasive loss. Evolution. 71 (4), 923-935 (2017).
- Shen, B., Han, X., Zhang, J., Rossiter, S. J., Zhang, S. Adaptive evolution in the glucose transporter 4 gene Slc2a4 in Old World fruit bats (family: Pteropodidae). PLoS ONE. 7 (4), e33197 (2012).
- Rojas, D., Warsi, O. M., Dávalos, L. M. Bats (Chiroptera: Noctilionoidea) challenge a recent origin of extant neotropical diversity. Systematic Biology. 65 (3), 432-448 (2016).
- Vonhof, M. J., Russell, A. L. Genetic approaches to the conservation of migratory bats: a study of the eastern red bat (Lasiurus borealis). PeerJ. 3, e983 (2015).
- Korstian, J. M., Schildt, A. J., Bennett, V. J., Williams, D. A., Hale, A. M. A method for PCR-based identification of bat species from fecal samples. Conservation Genetics Resources. 7 (4), 803-806 (2015).
- Bailey, S. E., et al. The use of museum samples for large-scale sequence capture: A study of congeneric horseshoe bats (family Rhinolophidae). Biological Journal of the Linnean Society. 117 (1), 58-70 (2016).
- Boston, E. S. M., et al. Empirical assessment of non-invasive population genetics in bats: Comparison of DNA quality from faecal and tissue samples. Acta Chiropterologica. 14 (1), 45-52 (2012).
- Puechmaille, S. J., Mathy, G., Petit, E. J. Good DNA from bat droppings. Acta Chiropterologica. 9 (1), 237-249 (2007).
- Corthals, A., et al. From the field to the lab: Best practices for field preservation of bat specimens for molecular analyses. PLoS ONE. 10 (3), 1-12 (2015).
- Kacprzyk, J., Teeling, E. C., Kelleher, C., Volleth, M. Wing membrane biopsies for bat cytogenetics: Finding of 2n = 54 in Irish Rhinolophus hipposideros (Rhinolophidae, Chiroptera, Mammalia) supports two geographically separated chromosomal variants in Europe. Cytogenetic and Genome Research. 148 (4), 279-283 (2016).
- Greville, L. J., Ceballos-Vasquez, A., Valdizón-Rodríguez, R., Caldwell, J. R., Faure, P. A. Wound healing in wing membranes of the Egyptian fruit bat (Rousettus aegyptiacus) and big brown bat (Eptesicus fuscus). Journal of Mammalogy. 99 (4), 974-982 (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 403-414 (2018).
- Shaw, T. I., et al. Transcriptome sequencing and annotation for the Jamaican fruit bat (Artibeus jamaicensis). PLoS one. 7 (11), e48472 (2012).
- Seim, I., et al. Genome analysis reveals insights into physiology and longevity of the Brandt’s bat Myotis brandtii. Nature communications. 4, 2212 (2013).
- Lei, M., Dong, D., Mu, S., Pan, Y. H., Zhang, S. Comparison of brain transcriptome of the greater horseshoe bats (Rhinolophus ferrumequinum) in active and torpid episodes. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Lee, A. K., et al. De novo transcriptome reconstruction and annotation of the Egyptian rousette bat. BMC Genomics. 16 (1), 1-11 (2015).
- Francischetti, I. M. B., et al. The “Vampirome”: Transcriptome and proteome analysis of the principal and accessory submaxillary glands of the vampire bat Desmodus rotundus, a vector of human rabies. Journal of Proteomics. 82, 288-319 (2013).
- Wen, M., et al. Exploring the genome and transcriptome of the cave nectar bat Eonycteris spelaea with PacBio long-read sequencing. GigaScience. (September), 1-8 (2018).
- Gonzalez-Garay, M. L. Introduction to isoform sequencing using pacific biosciences technology (Iso-Seq). Transcriptomics and Gene Regulation. , 141-160 (2016).
- Paulo, J. A., Lee, L. S., Banks, P. A., Steen, H., Conwell, D. L. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded pancreatic tissue using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Pancreas. 41 (2), 175 (2012).
- Wiśniewski, J. R. Proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. (79), (2013).
- Sadier, A., et al. Evidence for multifactorial processes underlying phenotypic variation in bat visual opsins. bioRxiv. , 300301 (2018).
- Sotero-Caio, C. G., et al. Integration of molecular cytogenetics, dated molecular phylogeny, and model-based predictions to understand the extreme chromosome reorganization in the Neotropical genus Tonatia (Chiroptera: Phyllostomidae). BMC Evolutionary Biology. 15 (1), 1-15 (2015).
- Baker, R. J., Hamilton, M. J., Parish, D. A. . Preparations of mammalian karyotypes under field conditions. , (2003).
- Song, H., Buhay, J. E., Whiting, M. F., Crandall, K. A. Many species in one: DNA barcoding overestimates the number of species when nuclear mitochondrial pseudogenes are coamplified. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (36), 13486-13491 (2008).
- Pooniya, S., Lalwani, S., Raina, A., Millo, T., Das Dogra, T. Quality and quantity of extracted deoxyribonucleic Acid (DNA) from preserved soft tissues of putrefied unidentifiable human corpse. Journal of Laboratory Physicians. 6 (1), 31 (2014).
- Camacho-Sanchez, M., Burraco, P., Gomez-Mestre, I., Leonard, J. A. Preservation of RNA and DNA from mammal samples under field conditions. Molecular Ecology Resources. 13, 663-673 (2013).
- Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Current Protocols in Cell Biology. 66 (1), 1 (2015).
- Database, J. S. E. Using a hemacytometer to count cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2018).
- Dávalos, L. M., Velazco, P. M., Warsi, O. M., Smits, P. D., Simmons, N. B. Integrating incomplete fossils by isolating conflicting signal in saturated and non-independent morphological characters. Systematic Biology. 63 (4), 582-600 (2014).
- Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA Integrity Number (RIN)-Standarization of RNA quality control. Nano. , 1-17 (2004).
- Leary, S., et al. . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
- Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post morterm interval. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
- Hecht, A. M., Braun, B. C., Krause, E., Voigt, C. C., Greenwood, A. D., Czirják, G. Plasma proteomic analysis of active and torpid greater mouse-eared bats (Myotis myotis). Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).
- Ball, H. C., Levari-Shariati, S., Cooper, L. N., Aliani, M. Comparative metabolomics of aging in a long-lived bat: Insights into the physiology of extreme longevity. PLoS ONE. 13 (5), 1-20 (2018).
- Kacprzyk, J., et al. A potent anti-inflammatory response in bat macrophages may be linked to extended longevity and viral tolerance. Acta Chiropterologica. 19 (2), 219-228 (2017).
- Littlefair, J. E., Clare, E. L. Barcoding the food chain: from Sanger to high-throughput sequencing. Genome. 59 (11), 946-958 (2016).
- Phillips, C. D., et al. Microbiome analysis among bats describes influences of host phylogeny, life history, physiology and geography. Molecular Ecology. 21 (11), 2617-2627 (2012).
- Carrillo-Araujo, M., et al. Phyllostomid bat microbiome composition is associated to host phylogeny and feeding strategies. Frontiers in Microbiology. 6 (May), 1-9 (2015).
- Hughes, G. M., Leech, J., Puechmaille, S. J., Lopez, J. V., Teeling, E. C. Is there a link between aging and microbiome diversity in exceptional mammalian longevity?. PeerJ. 6, e4174 (2018).
- Pannkuk, E. L., et al. Fatty acid methyl ester profiles of bat wing surface lipids. Lipids. 49 (11), 1143-1150 (2014).
- Pannkuk, E. L., et al. Glycerophospholipid profiles of bats with white-nose syndrome. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (4), 425-432 (2015).
