Summary

蝙蝠组织收集 -细胞分析和原细胞培养

Published: October 23, 2019
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Summary

这是一种方案,用于对在野外捕获的蝙蝠进行基因组、转录组和蛋白组分析的最佳组织制备。它包括蝙蝠捕获和解剖、组织保存和蝙蝠组织细胞培养的协议。

Abstract

随着高通量测序技术的进步,高质量组织采集和保存的标准化方法允许将这些方法扩展到非模型生物体。为一系列高通量测序方法开发了一系列优化蝙蝠组织收集的方案。这里概述了捕获蝙蝠的协议、为每个蝙蝠收集所需的人口统计数据,以及优化方法,以在组织采集过程中将蝙蝠的压力降至最低。具体概述的方法用于收集和治疗组织,以获得 (i) 用于高分子量基因组分析的 DNA,(ii) 组织特异性转录组RNA和 (iii) 蛋白质组级分析的蛋白质。最后,还概述了一种通过从翼夹创建可行的原细胞培养物来避免致命采样的方法。这些方法的一个中心动机是最大化每只蝙蝠的潜在分子和形态数据量,并提出保存组织的最佳方式,以便它们随着新方法在未来的发展而保持其价值。随着世界各地出现了对染色体级、无误差的物种基因组进行测序的倡议,这种标准化变得尤为重要,其中多个科学方正在带头对不同的分类学进行测序。组。此处概述的协议定义了 Bat1K 的理想组织收集和组织保存方法,该联合体负责对每种蝙蝠的基因组进行测序。

Introduction

高通量测序 (HTS) 方法在效率上迅速提高,成本降低,现在可以将这些方法扩展到数百或数千个样本。这些技术的应用所获得的见解在从生物医学到进化生态学1、2、3等多个科学学科中有着巨大的影响。然而,许多HTS应用严重依赖来自活源的高质量核酸。随着基于长读分子4的第三代测序的发展,这种限制可能会变得越来越成问题。出于这些原因,需要集中力量建立从实验室外的野生生物中收集新鲜组织样本的最佳做法,从而最大限度地发挥材料的效用,减少需要收集。

Bat1K是一个国际科学家联盟,目前正在将每种蝙蝠的基因组测序到染色体级集合5。蝙蝠代表了哺乳动物多样性的20%,具有特殊的适应,对理解衰老、疾病生态学、感官生物学和新陈代谢有影响。许多蝙蝠也由于人类剥削而受到威胁或濒危,或由于病原体8、9而迅速减少,基因组测序对于保护这些物种非常重要。尽管 Bat1K 目前的目标是对所有蝙蝠物种的基因组进行测序,但为高质量基因组测序收集组织样本的标准化仍然是整个生物体生物学家群体面临的一项关键挑战。除了基因组数据外,对蝙蝠适应多样性的功能理解还需要组织特定的转录组和蛋白质分析,通常需要单独的采集方案。此外,与所有分类组一样,虽然最佳组织收集和保存对于获得最高质量的数据进行-组学分析至关重要,但由于技术和快速变化,交流最佳做法往往很困难。多个研究团队独立工作。

鉴于许多蝙蝠物种很少或受到威胁,需要采用蝙蝠-组学研究的最佳做法尤为迫切。与其他小型哺乳动物(如啮齿动物和精明动物)不同,蝙蝠寿命长,由于特殊的DNA修复机制10和缓慢繁殖11,大多数物种每年只产一只或(少数)两只幼。由于这些原因,蝙蝠种群可能缓慢地从干扰中恢复,从野外采集许多个体既不可取,也不可行。换句话说,必须优化协议,以获得单个样本的最大数据量,从而减少不必要地复制采样工作的需求。

在这里,该协议特别侧重于用于基因组和转录组测序和蛋白质分析的蝙蝠组织的收集和采样的标准化方法。其最高优先事项是确保蝙蝠组织以合乎道德和负责任的方式收集,从采集许可程序、组织出口到尽量减少对动物的压力,以及长期储存条件。精心剖面,目的是面向未来,证明所收集不同材料的有用性。本手稿提供了一个分步指南,以人道的方式收集蝙蝠,旨在尽量减少对人口的影响,并最大化科学价值。虽然该协议的重点是专门用于蝙蝠,但许多步骤是相关的其他脊椎动物分类,特别是哺乳动物。

组织收集概述
组织收集程序,包括储存温度和选择保存剂,将由计划的任何下游分析的性质决定。然而,强烈建议在可能的情况下,在一系列方法下收集组织,以最大限度地发挥其未来效用,即使没有计划进行具体分析。一般来说,组织被收集和保存,以便随后分析核酸(DNA和RNA)或蛋白质。对于每种应用,通过直接在液氮 (LN2) 中快速冻结,可以最佳地保存组织。然而,在现场并不总是能够立即浸入 LN2。随着技术的进步,在环境温度下储存DNA和RNA的专用小瓶等资源越来越容易获得。虽然我们还没有验证本协议中的所有此类材料,但我们鼓励其他研究人员相对地分析新材料相对于我们这里的性能。在无法访问 LN2 的情况下,例如,由于在亚马逊的小型平面进行站点访问而无法进行 LN2 传输时,我们确实提供了为不同应用提供理想的保存组织的方法。此外,我们还提供了一种收集组织的方法,从中可以生长和繁殖活细胞。下面我们概述了为上述每个目的收集材料的关键注意事项,表1概述了收集方法。

脱氧核糖核酸组织
对于采集的所有采集组织,存储介质将确定其是否可用于标准或高分子量 (HMW) DNA 提取。HMW 是长读测序所必需的,目前需要生成染色体级基因组组件或”白金标准”基因组。低分子量 (LMW) DNA 可以从闪存冷冻、AllProtect(因此称为”组织稳定溶液”),甚至 RNAlater(因此”RNA 稳定溶液”)保存的样品中提取(尽管闪光冷冻样品保持最佳).通过标准实验室方法(例如,硅胶膜旋转柱、苯酚氯仿)分离的DNA仍可能产生高达20千基(kb)的DNA片段。因此,只要有足够的产量,这种形式的分离DNA可用于单刀片大小库制备,其中插入大小通常为+500基对(bp),并生成±100 bp的短序列读取12。这种DNA对于不需要全长染色体数据的”重新测序”项目或研究特别有用。HMW DNA (10-150 kb) 更具挑战性,只能使用收获后在 LN2 中快速闪光冻结的组织可靠地获得,并在-80°C中保持至-80°C,直到提取。

低分子量或支离破碎的DNA通常足以用于靶向方法,包括通过PCR和短读测序13进行基因扩增。基于PCR的研究使用LMWDNA,只针对一个或几个基因已经高度信息,了解适应和分子进化蝙蝠感官生物学6,14,生理学15,植物遗传学5,16,保存17,18。成功靶向序列重获低分子量和碎片DNA也已证明为许多脊椎动物群,包括蝙蝠19。这些方法通常具有成本效益,对蝙蝠具有微微侵入性,因为粪便样本和非致命组织通过拭子或翼活检打孔进行取样也是获得低分子量分析DNA的常用方法。 21.

但是,质量在很大程度上取决于存储样本的介质类型22。经过对buccal拭子和活检冲孔的系统定量比较,机翼活检液的拳头已经证明能持续产生更高的DNA水平,在采集22过程中对蝙蝠的压力较小。这些比较还表明,当翼冲剂保存在指示器二氧化硅(即一种由硅胶珠制成的干燥剂,在观察到水分时改变颜色)时,而不是在其他流行的储存介质(如乙醇或DMSO22;但是,其他存储介质,包括组织稳定溶液没有被检查。翼冲也可用于在培养中生长成纤维细胞,如在Kacprzyk等人23和下述(见第6节)。对于这些方法,应轻轻扩展机翼或尿毒症,并应使用直径为 3 mm 的清洁活检冲床来获取样品。这种方法似乎不会造成持久的伤害,在大多数情况下,疤痕在几周内愈合。

HMW DNA (10-150 kb) 更具挑战性,目前仅使用收获后在 LN2 中快速闪光冻结的组织获得可靠,并在 -80°C 中保持至 -80°C,直到提取。HMW DNA (10-150 kb) 对于长期读取的 DNA 测序至关重要,因此对于 de novo 基因组组装至关重要。事实上,虽然大多数商业试剂盒可用于分离一些标准的HMW DNA,但产生的分子尺寸往往不符合第三代测序技术的要求,例如太平洋生物科学(PacBio)等公司推出的技术,牛津纳米孔技术,和10x基因组学,或通过生物纳米基因组学或多尾基因组学提供的组装方法*。因此,对”超 HMW”DNA(>150 kb)有新的需求。当从蝙蝠获得超HMWDNA时,肝脏、大脑或肌肉的新鲜样本都适合,但这些样本必须立即在LN2中闪光冷冻,没有任何存储缓冲液或冷冻保护剂。这些步骤的完整描述超出了本文的范围,但可在其他部分25提供。

RNA组织
RNA是一种单链分子,其稳定性低于DNA。虽然有多种形式的RNA,-组分分析往往侧重于mRNA(信使RNA)和小型RNA(例如微RNA)。转录后,mRNA被拼接成一个成熟的转录本,其中不包含内创体,并代表基因/基因组的编码部分。编码基因只占基因组大小的一小部分(1%-2%),使靶向mRNA成为获取基因序列数据的具有成本效益的方法。微RNA是一类RNA,用于调节mRNA转化为蛋白质的过程,因此是重要的调节效应者。RNA转录本可以单独排序,或者更常见地用于-omics分析26,27,28,29,30,作为转录本的一部分;即给定样本中存在的所有RNA转录本的总数。

排序可以按照多种方法执行(即,通过短读RNA-seq或长读全异形Seq),允许分析RNA丰度和异形使用。由于mRNA转录本的数量和多样性在细胞和组织之间不同,RNA测序使得研究和比较不同样本的基因表达和调控成为可能。随着这些方法在生物学上越来越丰富,对小型RNA和全等形测序测序的兴趣正在增长。组织样本的制备,以序列不同类别的RNA可以执行的方式,如本手稿中介绍,只有随后的提取方法不同31,32。最后,由于转录组提供了蛋白质编码基因组的高覆盖率子集,因此组装的数据集在基因组组装和注释方面可能有用,因此跨一系列不同组织收集RNA-seq数据是Bat1K 计划。

与DNA相比,RNA在化学上不稳定,并且也是RNase酶的目标,这些酶在组织裂解物中普遍存在,作为对抗RNA病毒的防御策略。由于这些原因,细胞和组织中的RNA分数在取样和/或安乐死后不久开始降解。因此,保存RNA需要采取措施防止其降解。这通常涉及在稳定剂(如RNA稳定溶液)中保存4°C下新收集的组织,以灭活组织中自然存在的RNases,然后冷冻以进行长期储存。作为首选的替代方案,组织可在LN2中闪光冷冻;虽然如上所述,将LN2运送到现场并保持水平以防止组织解冻在后勤上可能具有挑战性。

蛋白质组织
蛋白质组成和相对丰度在细胞和组织之间以与RNA讨论的方式相似;然而,蛋白质平均比RNA更稳定。使用蛋白质组学进行蛋白质鉴定通常与蛋白质序列的一小部分(而不是整个蛋白质序列)相匹配,但它可以提供有关组织间表达的信息,并表征存在病原体。由于许多蛋白质序列在哺乳动物中保存,蛋白质组学的蝙蝠样本很容易被保存的人类蛋白质污染,在采集过程中需要无菌方案(例如手套、钳子)。虽然LN2中的闪冻结是防止蛋白质降解的最好方法,但如果没有其他方法,使用干冰、-20°C冰柜,甚至冰是合适的。随着温度的升高,蛋白质分裂的风险也会增加。组织稳定溶液等稳定剂在室温下有效保存组织的蛋白质部分,适合在闪光冷冻不可行时进行短期保存(最多一周)。

给定组织的酶轮廓直接影响其中蛋白质的保存。具有低酶活性的组织(如肌肉)即使在家庭冰柜的较高温度下也能保留蛋白质的轮廓。相比之下,肝脏组织是酶反应的,其蛋白质在制备过程中有更高的降解概率。越来越多的协议从甲苯固定石蜡嵌入(FFPE)样品获取人类蛋白质组谱,这表明,当采集时冷冻时,组织甲醛固定有望实现低成本蛋白质保存可行33,34.虽然高度依赖于保存时间和条件,蛋白质已经通过免疫性化学从形式固定,乙醇保存蝙蝠标本35鉴定。这种方法无法扩展到蛋白质组级采样,但突出表明,当闪存冻结不可用且其他稳定剂成本过高时,正式固定蝙蝠组织可能产生蛋白质配置文件。

细胞培养组织
取样组织和闪光冷冻提供了有限的材料可供使用,一旦材料被使用,它不再可用。或者,细胞培养物提供活细胞,可以立即用于或保存用于未来的研究。培养也促进细胞的膨胀,当组织样本较小时提高产量。在组织收集有限的情况下,它特别有用,例如对稀有物种进行实验,其中非致命性取样至关重要,因此对养护具有广泛影响。描述是一种方案,其中细胞培养可以通过翼膜组织的非致命采样,但培养是可能的与多种组织类型36,37。此处提供的协议为粘附单元选择。源组织和生长介质的组合使该协议适合选择和生长成纤维细胞,但如果需要,替代协议可用于选择其他细胞类型。在Bat1K项目的背景下,据预测,对于稀有和受威胁的物种,对翼膜进行非致命性取样和通过培养扩大样品对于产生采用多种技术所需的DNA数量至关重要。.

蝙蝠捕获
所有处理蝙蝠的人都应接受蝙蝠能力研究人员的培训,并接种一系列接触前注射疫苗,以预防狂犬病。如果被咬伤,还需要再注射一系列暴露后注射。捕捉蝙蝠的标准方法包括雾网(图1)和竖琴陷阱(图2)。雾网是最常用的,非常适合低到中度活动的地区,因为它们需要最小心,以尽量减少蝙蝠的苦恼。小蝙蝠特别脆弱,如果不迅速死亡,可能会因压力而死亡。频繁的净检查最大限度地减少了蝙蝠伤害和死亡率以及雾网损坏。这个细节很重要,因为适当的组织收集需要组织是新鲜的,对蝙蝠的雾网的不当关注可能导致不必要的死亡或过早死亡,研究人员才能正确处理样本。由于几只蝙蝠可以以最小的痛苦在竖琴陷阱中休息,因此这种方法非常适合蝙蝠活动量高的区域,如洞穴附近或大型栖息区。补充方法中提供了关于适当捕获蝙蝠和数据处理以收集形态和人口信息的详细说明。

Protocol

这里描述的所有方法都已获得石溪大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准(#2013-2034年协议)。 1. 安乐死 用异透麻醉剂或其他可用的麻醉剂润湿棉球。 将棉球放入可重新密封的密封塑料袋中。袋子应该足够大,可以舒适地放在布蝙蝠袋中。 几分钟后,让袋子中弥漫着麻醉剂,将装有蝙蝠的蝙蝠袋放入塑料袋中。 等待几分钟,直到蝙蝠被…

Representative Results

Dna对于标准低分子量 (LMW) 分析,从三个新热带蝙蝠物种中提取了 DNA。根据本文件所述的协议,从多米尼加共和国和哥斯达黎加的实地采集了组织样本。解剖后,将混合组织(脑、肝、肠)的小块(最薄部分为<0.5cm)放入RNA稳定溶液中,闪速冷冻,然后储存在-80°C。提取使用标准DNA提取协议与RNase处理43。使用自动电泳工具评估DNA完整性…

Discussion

本手稿中讨论的协议描述了蝙蝠各种高通量分子分析的最佳采样实践。所有成功的-组质研究都需要高质量的组织,但取样蝙蝠组织以及其他非模型生物,往往发生在无法设定为与受控实验室环境相同的标准的现场条件下。取样通常发生在偏远地区,资源很少,包括使用电力和冰柜的机会有限。很难,而且往往不可能确保完全无菌的取样条件。因此,概述的是在各种取样地点和现场条件下被确定为…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们感谢CEBIO、埃里卡·帕利扎、米卢斯卡·桑切斯、豪尔赫·卡雷拉、埃德加·伦吉福·巴斯克斯、哈罗德·波罗卡雷罗·扎里亚、豪尔赫·鲁埃兹·莱沃、海梅·佩切科·卡斯蒂略、卡洛斯·特洛、范尼·科内霍和范尼·费尔南德斯·梅洛制作纸巾收集在秘鲁可能。我们还感谢JaraguaGrupo Jaragua和Yolanda León的所有成员在多米尼加共和国进行组织采集,并感谢伯纳尔·罗德里格斯·埃尔南德斯、伯纳尔·马塔里塔和哥斯达黎加拉塞尔瓦生物研究站的每个人采样可能。我们感谢Ella Lattenkamp和Lutz Wiegrebe为细胞培养生成提供从Phyllostomus变色蝙蝠的翅膀冲头的获取和样本收集。细菌变色蝙蝠起源于慕尼黑路德维希-马克西米利安大学生物系II的繁殖地。慕尼黑地区兽医办公室批准了饲养和繁殖蝙蝠。LMD、SJR、KTJD 和 LRY 由 NSF-DEB 1442142 提供资金。LMD 由 NSF-DEB 1838273 提供资金。LRY 由 NSF-PRFB 1812035 提供资金。SCV 和 PD 由马克斯·普朗克研究小组奖和人类前沿科学计划 (HFSP) 研究资助 (RGP0058/2016) 资助。SJR、JHTP和KTJD由欧洲研究理事会(ERC启动赠款310482[EVOGENO])资助给SJR,ECT由欧洲研究理事会赠款(ERC-2012-StG311000)资助。

Materials

1.5 mL Eppendorf Safelock tubes Fischer Scientific 10509691 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol
15 mL tubes Sarstedt 62,554,002 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol
2 mL cryovials Thomas Scientific 1154P75 cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen
3-mm biopsy punch Medline MIL3332 wing biopsy punch for cell culture
6 well plate Greiner 83,392 Culture vessle
Allprotect Tissue Reagent Qiagen 76405 for fecal samples; tissue stabilizing solution
Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber Bio-Rad 145-0011 Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad
collagenase IV Stemcell Technologies 7909 For dissociation of primary cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650-5X5ML Prevents crystalization of water during freezing of the cells.
DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 12491-015 culture media
Dulbecco's PBS Invitrogen 14190169 Balanced salt solution used for washing cells
Fetal bovine serum (FBS) Fischer Scientific 10270106 Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells
Gentamycin sulfate salt Sigma Aldrich G1264-250MG Antibiotic for culture media
Nalgene Mr. Frosty Thermo Scientific 5100-0050 Freezing container which provides 1°C/min cooling rate
PARAFILM Sigma P7793 Wrapping tubes etc for sealing
Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x Invitrogen 15140130 Antibiotic for culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 Thermo Fisher 10010023 salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water
RNAlater Thermo Fisher AM7021 RNA stabilizing solution
RNAse away Genetech 83931-250mL breaks down enzymes that lead to RNA degradation
Silica gel Fisher Scientific 7631-86-9 dessicant agent
TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 1450102 Automated cell counter
Trypan blue Bio-Rad 145-0013 Cell stain used to assess cell viability
trypsin-EDTA Sigma Aldrich T4049 For dissociation of cells during splitting

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Citazione di questo articolo
Yohe, L. R., Devanna, P., Davies, K. T., Potter, J. H., Rossiter, S. J., Teeling, E. C., Vernes, S. C., Dávalos, L. M. Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture. J. Vis. Exp. (152), e59505, doi:10.3791/59505 (2019).

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