Vævs samling af flagermus til omics-analyser og primær cellekultur
Summary
Dette er en protokol for optimal vævs forberedelse til genomisk, transkriptomic og proteomiske analyser af flagermus fanget i naturen. Det omfatter protokoller for flagermus opsamling og dissektion, vævs bevaring, og celledyrkning af bat væv.
Abstract
Som high-gennemløb sekvensering teknologier forhånd, standardiserede metoder til høj kvalitet væv erhvervelse og bevaring giver mulighed for udvidelse af disse metoder til ikke-model organismer. En række protokoller til optimering vævs indsamling fra flagermus er blevet udviklet til en række High-gennemløb sekvensering tilgange. Skitseret her er protokoller til opsamling af flagermus, ønskede demografi, der skal indsamles for hver flagermus, og optimerede metoder til at minimere stress på en flagermus under vævs indsamling. Specifikt skitseret er metoder til indsamling og behandling af væv for at opnå (i) DNA for høj molekylvægt genomiske analyser, (II) RNA for vævsspecifikke transkriptomer, og (III) proteiner til proteomisk-niveau analyser. Endelig er også skitseret en metode til at undgå dødbringende prøvetagning ved at skabe levedygtige primære cellekulturer fra vinge klip. En central motivation af disse metoder er at maksimere mængden af potentielle molekylære og morfologiske data for hvert bat og foreslå optimale måder at bevare væv, så de bevarer deres værdi som nye metoder udvikler sig i fremtiden. Denne standardisering er blevet særlig vigtig som initiativer til sekvens kromosom-niveau, fejlfri genomer af arter i hele verden er dukket op, hvor flere videnskabelige partier er i spidsen for sekventering af forskellige taksonomiske Grupper. De protokoller, der er skitseret heri definerer den ideelle vævs indsamling og vævs bevaring metoder til Bat1K, konsortiet, som er sekventering af genomer af alle arter af bat.
Introduction
High-gennemløb sekvensering (HTS) metoder har hurtigt fremskreden i effektivitet og faldt i omkostninger, og det er nu muligt at skalere disse tilgange til hundreder eller tusinder af prøver. Indsigter opnået ved anvendelse af disse teknologier har enorme virkninger på tværs af flere videnskabelige discipliner, fra biomedicin til evolution og økologi1,2,3. Endnu, mange HTS applikationer stole kritisk på høj kvalitet nukleinsyre syrer fra en levende kilde. Denne begrænsning vil sandsynligvis blive stadig mere problematisk med udviklingen af tredje generations sekvensering baseret på lang læste molekyler4. Af disse årsager er der behov for at koncentrere indsatsen om at fastlægge bedste praksis for indsamling af fersk vævsprøver fra vilde organismer uden for laboratoriet, hvilket maksimerer materialets nytteværdi og reducerer antallet af individer, der skal Indsamlet.
Bat1K er et internationalt konsortium af videnskabsfolk med et igangværende initiativ til at sekvens genom af alle arter af bat til kromosom-niveau forsamling5. Flagermus repræsenterer 20% af pattedyrs mangfoldighed og har exceptionelle tilpasninger, der har betydning for forståelsen af aldring, sygdoms økologi, sensorisk biologi og metabolisme5,6. Mange flagermus er også truet eller truet på grund af menneskelig udnyttelse7 eller er hastigt faldende på grund af patogener8,9, og genomniveau sekvensering er af stor betydning for bevarelsen af disse arter. Selv om Bat1K i øjeblikket har til formål at sekvense genomer af alle bat-arter, er standardiseringen af indsamlingen af vævsprøver for genomisk sekvensering af høj kvalitet fortsat en central udfordring i hele Fællesskabet af organismal biologer. Ud over genomdata kræver funktionel forståelse af de forskellige bat-tilpasninger vævsspecifikke transkriptomer og proteinanalyser, der ofte kræver særskilte indsamlings protokoller. Som med alle taksonomiske grupper er optimal vævs indsamling og-bevaring afgørende for opnåelse af data af højeste kvalitet til omics-analyser, men det er ofte vanskeligt at formidle bedste praksis på grund af teknologier, der hurtigt ændrer sig, og flere forskerteams, som arbejder selvstændigt.
Behovet for at indføre bedste praksis for forskning i bat-omic’er er særlig presserende, da mange flagermusarter er sjældne eller truede. I modsætning til andre små pattedyr som gnavere og spidde, er flagermus langtids levede, kan henføres til exceptionelle DNA reparationsmekanismer10 og langsom reproduktion11, med de fleste arter føder kun én eller (i nogle få tilfælde) to unge om året. Af disse grunde kan flagermus populationer være langsomme til at komme sig efter forstyrrelser, og indsamling af mange individer fra naturen er hverken tilrådeligt eller gennemførligt. Med andre ord skal protokollerne optimeres for at opnå den maksimale mængde data for en enkelt prøve, hvilket reducerer behovet for unødigt at replikere prøvetagnings indsatsen.
Her fokuserer denne protokol specifikt på standardiserede metoder til indsamling og prøvetagning af bat-væv for genomisk og transkriptomic sekvensering og proteinanalyser. Dens højeste prioritet er at sikre, at bat-væv indsamles etisk og ansvarligt, lige fra Tilladelsesprocessen for indsamling, eksport af væv til minimering af stress til dyret, og langsigtede opbevaringsforhold. Udførlige dissektioner er blevet udviklet med det formål at fremtidssikret nytten af forskellige materialer indsamlet. Dette manuskript giver en trin-for-trin guide til at indsamle flagermus på en human måde, der er beregnet til at minimere indvirkningen på populationer og maksimere videnskabelig værdi. Mens fokus i denne protokol er specifikt til brug i flagermus, mange af trinene er relevante for andre hvirveldyr taxa, især pattedyr.
Vævs samling, oversigt
Proceduren for vævs opsamling, herunder opbevaringstemperatur og valg af konserveringsmiddel, bestemmes af arten af de planlagte downstream-analyser. Men, det anbefales kraftigt, at, når det er muligt, væv er indsamlet under en række metoder til at maksimere sin fremtidige nytte, selv om der ikke er planlagt nogen specifik analyse. Generelt indsamles og bevares vævet for efterfølgende analyser af enten nukleinsyrer (DNA og RNA) eller protein. For hver af disse applikationer, væv kan optimeres optimalt ved direkte flash frysning i flydende nitrogen (LN2). Men, umiddelbar fordybelse i LN2 er ikke altid muligt i marken. Som teknologiske fremskridt, ressourcer såsom specialiserede hætteglas til at opbevare DNA og RNA ved omgivende temperaturer bliver mere let tilgængelige. Selvom vi ikke har valideret alle sådanne materialer i denne protokol, opfordrer vi andre forskere til at analysere ydeevnen af nye materialer relativt i forhold til det, vi præsenterer her. Vi giver metoder til ideelt at bevare væv til forskellige applikationer i situationer, hvor LN2 ikke kan tilgås, f. eks, når LN2 transport er ikke muligt på grund af site adgang via lille fly i Amazonas. Derudover giver vi en metode til opsamling af væv, hvorfra levende celler kan dyrkes og udbredes. Nedenfor skitserer vi vigtige overvejelser ved indsamling af materiale til hvert af disse respektive formål, og der gives en oversigt over indsamlingsmetoderne i tabel 1.
Væv til DNA
For alt høstet væv indsamlet, vil lagringsmediet afgøre, om det kan bruges til enten standard eller høj molekylvægt (HMW) DNA-ekstraktion. HMW er påkrævet ved langtids læsning og er i øjeblikket nødvendig for at generere kromosomniveau genom-samlinger eller et “Platinum-standard”-genom. Lavmolekyl vægt (LMW) DNA kan udvindes fra flash frosne, AllProtect (herefter benævnt “vævs stabiliserende opløsning”), eller endda RNAlater (fremover “RNA-stabiliserende opløsning”)-konserverede prøver (selvom flash frosne prøver forbliver optimale ). DNA isoleret ved standard laboratoriemetoder (f. eks. silicagel membran spin kolonner, phenol-chloroform), kan stadig give DNA-fragmenter på op til ~ 20 kilobaser (KB). Derfor, forudsat at der er tilstrækkelig udbytte, kan denne form for isoleret DNA anvendes til enkelt Indsæt størrelse bibliotek forberedelse, hvor skærstørrelse er ofte ~ 500 base-par (BP), og korte sekvens læsninger af ~ 100 BP genereres12. Dette DNA er især nyttigt til “gensekvensering” af projekter eller studier, hvor kromosomale data i fuld længde ikke er påkrævet. HMW DNA (10-150 KB) er mere udfordrende og kan kun pålideligt opnås ved hjælp af væv, der er blevet hurtigt flash frosset i LN2 efter høst og vedligeholdes ved et maksimum på-80 °C indtil ekstraktion.
Lav molekylvægt eller fragmenteret DNA er ofte tilstrækkeligt til målrettede tilgange, herunder genforstærkning via PCR og kort læsning af sekventering13. PCR-baserede undersøgelser med LMW-DNA, der kun er rettet mod et eller flere gener, har været meget informative i forståelsen af tilpasning og den molekylære evolution af bat sensorisk biologi6,14, fysiologi15, Phylogenetics 5,16og bevaring17,18. En vellykket målrettet sekvens generobringen af lav molekylvægt og fragmenteret DNA er også blevet påvist for talrige hvirveldyr grupper, herunder flagermus19. Disse metoder er ofte omkostningseffektive og minimalt invasive til flagermus, som fækale prøver og ikke-dødelig vævs prøvetagning via buccale servietter eller Wing biopsi slag er også almindelige måder at opnå DNA for lav molekylvægt analyser20, 21.
Men kvaliteten afhænger i høj grad af den type medier, hvor prøven er lagret22. Efter systematiske og kvantitative sammenligninger af buccale podninger og biopsi slag, fløj biopsi slag har vist sig at give konsekvent højere niveauer af DNA og var mindre stressende for flagermus under samlingen22. Disse sammenligninger viste også, at de bedste resultater blev opnået, når vinge punch blev bevaret i indikator silica (dvs. en type tørremiddel fremstillet af silica gel perler, der skifter farve, når fugt er observeret) snarere end i andre populære lagringsmedier såsom ethanol eller DMSO22; selv om andre lagringsmedier, herunder vævs stabiliserings opløsning, ikke blev undersøgt. Vingeslag kan også bruges til at dyrke fibroblast celler i kultur, såsom i Kacprzyk et al.23 og som beskrevet nedenfor (Se afsnit 6). For disse metoder bør vingen eller uropatagium forlænges forsigtigt, og en ren biopsi punch, typisk 3 mm i diameter, bør anvendes til at opnå prøven. Denne fremgangsmåde synes at forårsage ingen varige skader, med ar healing over inden for uger i de fleste tilfælde24.
HMW DNA (10-150 KB) er mere udfordrende og er i øjeblikket kun pålideligt opnået ved hjælp af væv, der er blevet hurtigt flash frosset i LN2 efter høst og vedligeholdes ved et maksimum på-80 °C indtil ekstraktion. HMW DNA (10-150 KB) er afgørende for lang læsning af DNA-sekvensering og derfor for de Novo genom-samlingen. Mens de fleste kommercielle kits kan bruges til at isolere nogle standard HMW-DNA, opfylder de resulterende molekyle størrelser ofte ikke kravene i tredje generations sekvensering teknologier [f. eks. dem, der lanceres af virksomheder som Pacific Biosciences (PacBio), Oxford Nanopore Technologies, og 10x Genomics, eller gennem Samlingsmetoder, der tilbydes af Bionano Genomics eller Dovetail Genomics]. Som sådan er der en ny efterspørgsel efter “ultra HMW” DNA (> 150 KB). Når der opnås ultra HMW DNA fra flagermus, friske prøver af leveren, hjernen, eller muskel er alle egnede, men disse skal straks blinke frosset i LN2 uden nogen lager buffer eller cryoprotectant. En fuldstændig beskrivelse af disse trin ligger uden for dette papirs anvendelsesområde, men findes andre steder25.
Væv til RNA
RNA er et enkeltstrenget molekyle, der er mindre stabilt end DNA. Selv om der er mange former for RNA,-omics analyser tendens til at fokusere på mRNA (Messenger RNA) og små RNAs (f. eks, microRNAs). Efter transskription, mRNA er splejret til at danne en moden afskrift, der indeholder ingen introns og repræsenterer kodning del af gener/genomer. Kodning gener tegner sig for en lille brøkdel af genom størrelse (1%-2%), hvilket gør målretning mRNA en omkostningseffektiv middel til at opnå sekvensdata for gener. MicroRNAs er en klasse af RNAs, der regulerer processen med oversættelse af mRNA til proteiner og er derfor vigtige regulerende effektorer. RNA-udskrifter kan sorteres enkeltvis eller mere almindeligt for-omics-analyser26,27,28,29,30, som en del af en transkriptom; Det betyder, at summen af alle RNA-udskrifter er til stede i en given prøve.
Sekvensering kan udføres efter flere metoder (dvs. via kort læsning af RNA-SEQ eller lang læsning af hele isoform SEQ), hvilket muliggør analyse af både RNA-overflod og brug af isoform. Da mængden og mangfoldigheden af mRNA-udskrifter varierer mellem celler og væv, gør RNA-sekvensering det muligt at studere og sammenligne genekspression og regulering på tværs af prøver. Interessen for sekvensering af små RNAs og hele isoform sekvensering er stigende, da disse metoder bliver mere og mere biologisk informative. Forberedelse af vævsprøver til sekvens af forskellige klasser af RNA kan udføres på samme måde som præsenteret i dette manuskript, med kun de efterfølgende ekstraktionsmetoder afviger31,32. Da transkriptomer giver et højt dæknings udsnit af protein kodnings genomet, kan det samlede datasæt være nyttigt i genom-samling og annotation, hvilket gør indsamlingen af RNA-SEQ-data på tværs af en række forskellige væv til en vigtig bestanddel af Bat1K initiativ.
I modsætning til DNA er RNA kemisk ustabil og også målrettet af Rnaseenzymer, som er allestedsnærværende i vævs lysater som en defensiv strategi mod RNA-baserede vira. Af disse grunde begynder RNA-fraktionen i celler og væv at nedbrydes kort efterprøve udtagnings-og/eller eutanasi-punktet. Bevarelse af RNA kræver derfor skridt til at forhindre dets nedbrydning. Dette indebærer typisk at bevare frisk opsamlet væv ved 4 °C i et stabiliserende middel, såsom RNA-stabiliserende opløsning, for at inaktivere de Rnaser, der naturligt findes i vævet, efterfulgt af frysning til langtidsopbevaring. Som et foretrukket alternativ, væv kan blinke frosset i LN2; selv som nævnt ovenfor, transporterer LN2 ind i marken og opretholde niveauer for at forhindre væv optøning kan være logistisk udfordrende.
Væv til protein
Protein sammensætning og relativ overflod varierer mellem celler og væv på samme måde som det, der blev drøftet for RNA; Men, proteiner er i gennemsnit mere stabile end RNA. Protein identifikation ved hjælp af proteomics typisk matcher en brøkdel af, og ikke hele, protein sekvens, men det kan give oplysninger om udtryk på tværs af væv og karakterisere patogener til stede. Da mange protein sekvenser bevares på tværs af pattedyr, kan bat-prøver for proteomics let kontamineres med bevaret menneskelige proteiner, der kræver sterile protokoller (f. eks. handsker, pincet) under indsamlingen. Mens flash-frysning i LN2 er den bedste måde at forhindre nedbrydning af proteiner, brug af tøris,-20 °C frysere, og selv is er egnet, hvis der ikke er andre midler. Da temperaturerne stiger, stiger risikoen for differentiel protein opdeling også. Stabiliserende stoffer som vævs stabiliserings løsning er effektive til at bevare proteinfraktionen af væv ved stuetemperatur og er velegnede til kortvarig bevaring (op til en uge), når flash-frysning ikke er rentabelt.
Den enzymatiske profil af et givet væv har direkte indflydelse på bevarelsen af protein deri. Væv med lav enzymatisk aktivitet såsom muskel kan bevare protein profiler selv ved de højere temperaturer i en husholdning fryser. Derimod er levervævet enzymatisk reaktivt, og dets proteiner har højere sandsynligheder for nedværdigende under tilberedningen. Det stigende antal protokoller for opnåelse af humane proteomiske profiler fra formalin-faste paraffin-indlejrede (FFPE) prøver tyder på, at PARAFORMALDEHYD fastgørelse af væv holder løfte om lave omkostninger protein bevarelse, når frysning ved indsamling ikke er muligt33,34. Selv om de er meget afhængige af konserverings tiden og-tilstanden, er proteiner blevet identificeret via Immunhistokemi fra formalin-faste, ethanol-bevarede bat-prøver35. Denne fremgangsmåde er ikke skalerbar til prøvetagning på proteomisk niveau, men fremhæver potentialet for formalin-faste bat-væv til at give protein profiler, når flash-frysning er utilgængelig, og andre stabiliserende stoffer er for dyre.
Væv til cellekultur
Prøveudtagning væv og flash-frysning tilbyder en begrænset mængde materiale, der skal anvendes, og når materialet er brugt, er det ikke længere tilgængelig. Alternativt, cellekulturer levere levende celler, der kan straks anvendes eller bevares til fremtidige undersøgelser. Kulturer også lette udvidelse af celler til at øge udbyttet, når vævsprøver er små. Det er særlig nyttigt i tilfælde, hvor vævs indsamlingen er begrænset, såsom eksperimenter med sjældne arter, hvor ikke-dødelig prøvetagning er afgørende og derfor har store konsekvenser for bevarelsen. Beskrevet er en protokol, hvor cellekulturen er mulig via ikke-dødelig prøvetagning af vinge membran væv, men dyrkning er mulig med flere vævstyper36,37. Den protokol, der er angivet her, vælger til vedlige celler. Kombinationen af kilde vævs-og vækstmedier bruges gør denne protokol egnet til at vælge og vokse fibroblaster, men hvis det ønskes, kan alternative protokoller bruges til at vælge for andre celletyper. I forbindelse med Bat1K-projektet forudses det, at for sjældne og truede arter er ikke-dødbringende prøveudtagning af vinge membraner og udvidelse af prøver via dyrkning afgørende for at frembringe den mængde DNA, der er nødvendig for de mange anvendte teknologier5 .
Bat Capture
Alle, der håndterer flagermus, bør uddannes af en bat-kompetent forsker og vaccineres mod rabies med en række præ-eksponerings injektioner. Hvis bidt, en yderligere række efter eksponering injektioner er stadig nødvendigt. Standard metoder til opsamling af flagermus omfatter tåge garn (figur 1) og harpe fælder (figur 2). Tåge garn bruges oftest og er ideelt til områder med lav til moderat aktivitet, da de kræver mest pleje for at minimere flagermus lidelse. Små flagermus er særligt sårbare og kan dø af stress, hvis ikke en tendens til hurtigt. Hyppige netto inspektioner minimerer flagermus skade og dødelighed samt beskadigelse af tåge nettet. Denne detalje er vigtig, fordi korrekt vævs indsamling kræver, at vævet skal være frisk, og ukorrekt opmærksomhed på tåge nettene i flagermus kan føre til unødvendig dødelighed eller for tidlig dødelighed, før forskeren kan behandle prøverne korrekt. Fordi flere flagermus kan hvile i en harpe fælde med minimal nød, denne tilgang er ideel til områder med høj flagermus aktivitet, såsom nær en hule eller store Roost. Detaljerede instruktioner til korrekt flagermus opsamling og databehandling til indsamling af morfologiske og demografiske oplysninger er tilgængelige i de supplerende metoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den protokol, som omtales i dette manuskript, beskriver den bedste prøveudtagnings praksis for forskellige molekylære analyser af flagermus med høj gennemløb. Alle vellykkede omics-undersøgelser kræver væv af høj kvalitet, men prøveudtagning af bat-væv samt andre ikke-modelorganismer forekommer ofte i feltforhold, der ikke kan indstilles til de samme standarder som i kontrollerede laboratorieomgivelser. Stikprøveudtagning sker ofte på fjerntliggende steder med minimale ressourcer, herunder begrænset adgang t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Centro de Ecología y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sánchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vásquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruíz leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo og Fanny Fernández Melo for at gøre vævs indsamling i Peru muligt. Vi takker også alle medlemmer af Grupo Jaragua og Yolanda León for at gøre vævs indsamling i den Dominikanske Republik muligt, samt til Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita, og alle på La Selva biologisk forsknings station i Costa Rica, for at gøre mulighed for stikprøveudtagning. Vi takker Ella Lattenkamp & Lutz Wiegrebe for adgang og prøve samling af vingeslag fra Phyllostomus misfarve flagermus til generering af cellekultur. Phyllostomus misfarende flagermus stammede fra en avls koloni i Department Biology II af Ludwig-Maximilians-universitetet i München. Godkendelse til at beholde og opdrætte flagermus blev udstedt af München distrikts Veterinærkontor. LMD, SJR, KTJD og LRY blev finansieret af NSF-DEB 1442142. LMD blev finansieret af NSF-DEB 1838273. LRY blev finansieret af NSF-PRFB 1812035. SCV og PD blev finansieret af en Max Planck-forskningsgruppe Award og et forskningsstipendium til human grænse Science program (HFSP) (RGP0058/2016). SJR, JHTP og KTJD blev finansieret af det Europæiske Forskningsråd (ERC start Grant 310482 [EVOGENO]) tildelt SJR, ECT blev finansieret af det Europæiske Forskningsråd (ERC-2012-StG311000).
Materials
| 1.5 mL Eppendorf Safelock tubes | Fischer Scientific | 10509691 | 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62,554,002 | 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 2 mL cryovials | Thomas Scientific | 1154P75 | cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen |
| 3-mm biopsy punch | Medline | MIL3332 | wing biopsy punch for cell culture |
| 6 well plate | Greiner | 83,392 | Culture vessle |
| Allprotect Tissue Reagent | Qiagen | 76405 | for fecal samples; tissue stabilizing solution |
| Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber | Bio-Rad | 145-0011 | Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad |
| collagenase IV | Stemcell Technologies | 7909 | For dissociation of primary cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | Prevents crystalization of water during freezing of the cells. |
| DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 12491-015 | culture media |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190169 | Balanced salt solution used for washing cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Fischer Scientific | 10270106 | Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells |
| Gentamycin sulfate salt | Sigma Aldrich | G1264-250MG | Antibiotic for culture media |
| Nalgene Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0050 | Freezing container which provides 1°C/min cooling rate |
| PARAFILM | Sigma | P7793 | Wrapping tubes etc for sealing |
| Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x | Invitrogen | 15140130 | Antibiotic for culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water |
| RNAlater | Thermo Fisher | AM7021 | RNA stabilizing solution |
| RNAse away | Genetech | 83931-250mL | breaks down enzymes that lead to RNA degradation |
| Silica gel | Fisher Scientific | 7631-86-9 | dessicant agent |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Automated cell counter |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | Cell stain used to assess cell viability |
| trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 | For dissociation of cells during splitting |
Riferimenti
- Jiao, W. B., Schneeberger, K. The impact of third generation genomic technologies on plant genome assembly. Current Opinion in Plant Biology. 36, 64-70 (2017).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Naquin, D., Thermes, C. The third revolution in sequencing technology. Trends in Genetics. 34 (9), 666-681 (2018).
- Lee, H., et al. Third-generation sequencing and the future of genomics. bioRxiv. , 048603 (2016).
- Mayjonade, B., et al. Extraction of high-molecular-weight genomic DNA for long-read sequencing of single molecules. BioTechniques. 62 (1), xv (2017).
- Teeling, E., et al. Bat biology, genomes, and the Bat1K project: To generate chromosome-level genomes for all living bat species. Annual Review of Animal Biosciences. 6 (12), 1-24 (2018).
- Jones, G., Teeling, E. C., Rossiter, S. J. From the ultrasonic to the infrared: molecular evolution and the sensory biology of bats. Frontiers in Physiology. 4 (117), 1-16 (2013).
- Vincenot, C. E., Florens, F. B. V., Kingston, T. Can we protect island flying foxes. Science. 355 (6332), 1368-1370 (2017).
- Blehert, D. S., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen?. Science. 323 (5911), 227 (2009).
- Foley, J., Clifford, D., Castle, K., Cryan, P., Ostfeld, R. S. Investigating and managing the rapid emergence of White Nose Syndrome, a novel, fatal, infectious disease of hibernating bats. Conservation Biology. 25 (2), 223-231 (2011).
- Foley, N. M., et al. Growing old, yet staying young: The role of telomeres in bats’ exceptional longevity. Science Advances. 4, (2018).
- Dammann, P. Slow aging in mammals—Lessons from African mole-rats and bats. Seminars in Cell and Developmental Biology. 70, 154-163 (2017).
- Tsagkogeorga, G., Parker, J., Stupka, E., Cotton, J. A., Rossiter, S. J. Phylogenomic analyses elucidate the evolutionary relationships of bats. Current Biology. 23 (22), 2262-2267 (2013).
- Rohland, N., Reich, D. C. o. s. t. -. e. f. f. e. c. t. i. v. e. high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Yohe, L. R., et al. Trpc2 pseudogenization dynamics in bats reveal ancestral vomeronasal signaling, then pervasive loss. Evolution. 71 (4), 923-935 (2017).
- Shen, B., Han, X., Zhang, J., Rossiter, S. J., Zhang, S. Adaptive evolution in the glucose transporter 4 gene Slc2a4 in Old World fruit bats (family: Pteropodidae). PLoS ONE. 7 (4), e33197 (2012).
- Rojas, D., Warsi, O. M., Dávalos, L. M. Bats (Chiroptera: Noctilionoidea) challenge a recent origin of extant neotropical diversity. Systematic Biology. 65 (3), 432-448 (2016).
- Vonhof, M. J., Russell, A. L. Genetic approaches to the conservation of migratory bats: a study of the eastern red bat (Lasiurus borealis). PeerJ. 3, e983 (2015).
- Korstian, J. M., Schildt, A. J., Bennett, V. J., Williams, D. A., Hale, A. M. A method for PCR-based identification of bat species from fecal samples. Conservation Genetics Resources. 7 (4), 803-806 (2015).
- Bailey, S. E., et al. The use of museum samples for large-scale sequence capture: A study of congeneric horseshoe bats (family Rhinolophidae). Biological Journal of the Linnean Society. 117 (1), 58-70 (2016).
- Boston, E. S. M., et al. Empirical assessment of non-invasive population genetics in bats: Comparison of DNA quality from faecal and tissue samples. Acta Chiropterologica. 14 (1), 45-52 (2012).
- Puechmaille, S. J., Mathy, G., Petit, E. J. Good DNA from bat droppings. Acta Chiropterologica. 9 (1), 237-249 (2007).
- Corthals, A., et al. From the field to the lab: Best practices for field preservation of bat specimens for molecular analyses. PLoS ONE. 10 (3), 1-12 (2015).
- Kacprzyk, J., Teeling, E. C., Kelleher, C., Volleth, M. Wing membrane biopsies for bat cytogenetics: Finding of 2n = 54 in Irish Rhinolophus hipposideros (Rhinolophidae, Chiroptera, Mammalia) supports two geographically separated chromosomal variants in Europe. Cytogenetic and Genome Research. 148 (4), 279-283 (2016).
- Greville, L. J., Ceballos-Vasquez, A., Valdizón-Rodríguez, R., Caldwell, J. R., Faure, P. A. Wound healing in wing membranes of the Egyptian fruit bat (Rousettus aegyptiacus) and big brown bat (Eptesicus fuscus). Journal of Mammalogy. 99 (4), 974-982 (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 403-414 (2018).
- Shaw, T. I., et al. Transcriptome sequencing and annotation for the Jamaican fruit bat (Artibeus jamaicensis). PLoS one. 7 (11), e48472 (2012).
- Seim, I., et al. Genome analysis reveals insights into physiology and longevity of the Brandt’s bat Myotis brandtii. Nature communications. 4, 2212 (2013).
- Lei, M., Dong, D., Mu, S., Pan, Y. H., Zhang, S. Comparison of brain transcriptome of the greater horseshoe bats (Rhinolophus ferrumequinum) in active and torpid episodes. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Lee, A. K., et al. De novo transcriptome reconstruction and annotation of the Egyptian rousette bat. BMC Genomics. 16 (1), 1-11 (2015).
- Francischetti, I. M. B., et al. The “Vampirome”: Transcriptome and proteome analysis of the principal and accessory submaxillary glands of the vampire bat Desmodus rotundus, a vector of human rabies. Journal of Proteomics. 82, 288-319 (2013).
- Wen, M., et al. Exploring the genome and transcriptome of the cave nectar bat Eonycteris spelaea with PacBio long-read sequencing. GigaScience. (September), 1-8 (2018).
- Gonzalez-Garay, M. L. Introduction to isoform sequencing using pacific biosciences technology (Iso-Seq). Transcriptomics and Gene Regulation. , 141-160 (2016).
- Paulo, J. A., Lee, L. S., Banks, P. A., Steen, H., Conwell, D. L. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded pancreatic tissue using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Pancreas. 41 (2), 175 (2012).
- Wiśniewski, J. R. Proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. (79), (2013).
- Sadier, A., et al. Evidence for multifactorial processes underlying phenotypic variation in bat visual opsins. bioRxiv. , 300301 (2018).
- Sotero-Caio, C. G., et al. Integration of molecular cytogenetics, dated molecular phylogeny, and model-based predictions to understand the extreme chromosome reorganization in the Neotropical genus Tonatia (Chiroptera: Phyllostomidae). BMC Evolutionary Biology. 15 (1), 1-15 (2015).
- Baker, R. J., Hamilton, M. J., Parish, D. A. . Preparations of mammalian karyotypes under field conditions. , (2003).
- Song, H., Buhay, J. E., Whiting, M. F., Crandall, K. A. Many species in one: DNA barcoding overestimates the number of species when nuclear mitochondrial pseudogenes are coamplified. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (36), 13486-13491 (2008).
- Pooniya, S., Lalwani, S., Raina, A., Millo, T., Das Dogra, T. Quality and quantity of extracted deoxyribonucleic Acid (DNA) from preserved soft tissues of putrefied unidentifiable human corpse. Journal of Laboratory Physicians. 6 (1), 31 (2014).
- Camacho-Sanchez, M., Burraco, P., Gomez-Mestre, I., Leonard, J. A. Preservation of RNA and DNA from mammal samples under field conditions. Molecular Ecology Resources. 13, 663-673 (2013).
- Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Current Protocols in Cell Biology. 66 (1), 1 (2015).
- Database, J. S. E. Using a hemacytometer to count cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2018).
- Dávalos, L. M., Velazco, P. M., Warsi, O. M., Smits, P. D., Simmons, N. B. Integrating incomplete fossils by isolating conflicting signal in saturated and non-independent morphological characters. Systematic Biology. 63 (4), 582-600 (2014).
- Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA Integrity Number (RIN)-Standarization of RNA quality control. Nano. , 1-17 (2004).
- Leary, S., et al. . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
- Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post morterm interval. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
- Hecht, A. M., Braun, B. C., Krause, E., Voigt, C. C., Greenwood, A. D., Czirják, G. Plasma proteomic analysis of active and torpid greater mouse-eared bats (Myotis myotis). Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).
- Ball, H. C., Levari-Shariati, S., Cooper, L. N., Aliani, M. Comparative metabolomics of aging in a long-lived bat: Insights into the physiology of extreme longevity. PLoS ONE. 13 (5), 1-20 (2018).
- Kacprzyk, J., et al. A potent anti-inflammatory response in bat macrophages may be linked to extended longevity and viral tolerance. Acta Chiropterologica. 19 (2), 219-228 (2017).
- Littlefair, J. E., Clare, E. L. Barcoding the food chain: from Sanger to high-throughput sequencing. Genome. 59 (11), 946-958 (2016).
- Phillips, C. D., et al. Microbiome analysis among bats describes influences of host phylogeny, life history, physiology and geography. Molecular Ecology. 21 (11), 2617-2627 (2012).
- Carrillo-Araujo, M., et al. Phyllostomid bat microbiome composition is associated to host phylogeny and feeding strategies. Frontiers in Microbiology. 6 (May), 1-9 (2015).
- Hughes, G. M., Leech, J., Puechmaille, S. J., Lopez, J. V., Teeling, E. C. Is there a link between aging and microbiome diversity in exceptional mammalian longevity?. PeerJ. 6, e4174 (2018).
- Pannkuk, E. L., et al. Fatty acid methyl ester profiles of bat wing surface lipids. Lipids. 49 (11), 1143-1150 (2014).
- Pannkuk, E. L., et al. Glycerophospholipid profiles of bats with white-nose syndrome. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (4), 425-432 (2015).
