Weefsel collectie van vleermuizen voor-omics analyses en primaire celcultuur
Summary
Dit is een protocol voor de optimale weefsel voorbereiding voor genomische, transcriptomische en proteomische analyses van vleermuizen die in het wild zijn gevangen. Het omvat de protocollen voor de inname van vleermuis en dissectie, weefsel conservering, en celculturing van vleermuis weefsel.
Abstract
Als high-throughput sequencing technologieën Advance, gestandaardiseerde methoden voor het verwerven en conserveren van weefsel van hoge kwaliteit zorgen voor de uitbreiding van deze methoden naar niet-model organismen. Een reeks protocollen om de weefsel verzameling van vleermuizen te optimaliseren is ontwikkeld voor een reeks benaderingen met hoge doorvoer sequentiëren. Hier geschetst zijn protocollen voor de inname van vleermuizen, gewenste demografische gegevens worden verzameld voor elke vleermuis, en geoptimaliseerde methoden om te minimaliseren van stress op een vleermuis tijdens weefsel verzameling. Specifiek beschreven zijn methoden voor het verzamelen en behandelen van weefsel om (i) DNA te verkrijgen voor genomische analysen met een hoog moleculair gewicht, (II) RNA voor Weefselspecifieke transcriptomen (III) eiwitten voor analyses op Proteomic-niveau. Tot slot, ook geschetst is een methode om dodelijke bemonstering te voorkomen door het creëren van levensvatbare primaire celculturen uit vleugel clips. Een centrale motivatie van deze methoden is om de hoeveelheid potentiële moleculaire en morfologische gegevens voor elke vleermuis te maximaliseren en optimale manieren te suggereren om weefsels te behouden, zodat ze hun waarde behouden als nieuwe methoden in de toekomst ontwikkelen. Deze standaardisatie is bijzonder belangrijk geworden als initiatieven voor het sequentiëren van chromosoom-niveau-en foutvrije genomen van soorten over de hele wereld zijn ontstaan, waarbij meerdere wetenschappelijke partijen de sequenties van verschillende taxonomische Groepen. De protocollen die hierin worden beschreven, definiëren de ideale methoden voor weefsel verzameling en weefsel conservering voor Bat1K, het consortium dat de genomen van elke soort vleermuis sequentieert.
Introduction
High-throughput sequencing (HTS) methoden zijn snel gevorderd in efficiëntie en lagere kosten, en het is nu mogelijk om deze benaderingen te schalen naar honderden of duizenden voorbeelden. Inzichten verkregen door de toepassing van deze technologieën hebben enorme impact op meerdere wetenschappelijke disciplines, van biomedische tot evolutie en ecologie1,2,3. Toch vertrouwen veel HTS-toepassingen kritisch op nucleïnezuren van hoge kwaliteit uit een levende bron. Deze beperking zal waarschijnlijk steeds problematischer worden met de ontwikkeling van sequencing van de derde generatie op basis van lang Lees moleculen4. Om deze redenen is het noodzakelijk om de inspanningen te concentreren op het vaststellen van beste praktijken voor het verzamelen van verse weefselmonsters van wilde organismen buiten het laboratorium, waardoor het nut van het materiaal wordt gemaximaliseerd en het aantal personen dat moet worden Verzameld.
Bat1K is een internationaal consortium van wetenschappers met een doorlopend initiatief om het genoom van elke soort vleermuis te sequenties op chromosoom niveau assembly5. Vleermuizen vertegenwoordigen 20% van de zoogdier diversiteit en hebben uitzonderlijke aanpassingen die implicaties hebben voor het begrijpen van veroudering, ziekte-ecologie, zintuiglijke biologie en metabolisme5,6. Veel vleermuizen worden ook bedreigd of bedreigd als gevolg van menselijke uitbuiting7 of snel afnemen als gevolg van pathogenen8,9, en Genome-niveau sequencing is van groot belang voor het behoud van deze soorten. Hoewel Bat1K momenteel tot doel heeft de genomen van alle BBT-soorten te sequentiëren, blijft de standaardisering van het verzamelen van weefselmonsters voor hoogwaardige genomische sequencing een belangrijke uitdaging in de Gemeenschap van organismale biologen. Naast de genomische gegevens vereist het functionele begrip van de diversiteit van de BBT-aanpassingen Weefselspecifieke transcriptome-en eiwit analyses, die vaak aparte inzamelings protocollen vereisen. Bovendien, zoals bij alle taxonomische groepen, terwijl optimale weefsel inzameling en-conservering essentieel is voor het verkrijgen van gegevens van de hoogste kwaliteit voor-omics-analyses, is het vaak moeilijk om beste praktijken te communiceren vanwege snel veranderende technologieën en meerdere onderzoeksteams werken zelfstandig.
De noodzaak om beste praktijken voor BBT-omics-onderzoek goed te keuren is met name urgent, gezien het feit dat veel vleermuissoorten zeldzaam of bedreigd zijn. In tegenstelling tot andere kleine zoogdieren zoals knaagdieren en spitsen, zijn vleermuizen lang geleefd, toe te schrijven aan uitzonderlijke DNA-herstelmechanismen10 en Slow reproductie11, met de meeste soorten die bevallen van slechts één of (in enkele gevallen) twee jonge per jaar. Om deze redenen kunnen vleermuis populaties traag zijn om te herstellen van verstoring, en het verzamelen van veel individuen uit het wild is noch wenselijk noch haalbaar. Met andere woorden, protocollen moeten worden geoptimaliseerd om de maximale hoeveelheid gegevens voor een enkel specimen te verkrijgen, waardoor de noodzaak om de bemonsterings inspanningen onnodig te repliceren, wordt verminderd.
Hier richt dit Protocol zich specifiek op gestandaardiseerde methoden voor het verzamelen en bemonsteren van BBT-weefsel voor genomische en transcriptomische sequencing en eiwit analyses. De hoogste prioriteit is ervoor te zorgen dat de BBT-weefsels op ethische en verantwoorde wijze worden verzameld, variërend van het vergunningsproces voor de inzameling, de uitvoer van weefsels tot de minimalisatie van stress naar het dier en de lange termijn opslagcondities. Er zijn uitgebreide dissecties ontwikkeld met als doel het nut van verschillende verzamelde materialen in de toekomst te testen. Dit manuscript biedt een stapsgewijze handleiding voor het verzamelen van vleermuizen op een humane manier die bedoeld is om de impact op de populaties te minimaliseren en de wetenschappelijke waarde te maximaliseren. Hoewel de focus van dit protocol specifiek is voor gebruik in vleermuizen, zijn veel van de stappen relevant voor andere gewervelde taxa, vooral zoogdieren.
Tissue collectie overzicht
De procedure voor het verzamelen van weefsels, met inbegrip van de temperatuur voor opslag en de keuze van de conserveringsmiddel, wordt bepaald door de aard van de geplande stroomafwaartse analyses. Echter, het is sterk aanbevolen dat, indien mogelijk, weefsel wordt verzameld onder een scala aan methoden om zijn toekomstige nut te maximaliseren, zelfs als er geen specifieke analyse is gepland. In het algemeen wordt weefsel verzameld en bewaard voor latere analyses van ofwel nucleïnezuren (DNA en RNA), of eiwitten. Voor elk van deze toepassingen, weefsel kan optimaal worden bewaard door direct Flash invriezen in vloeibare stikstof (LN2). Directe onderdompeling in LN2 is echter niet altijd mogelijk in het veld. Naarmate de technologie vordert, worden middelen zoals gespecialiseerde flacons om DNA en RNA bij omgevingstemperaturen op te slaan steeds gemakkelijker beschikbaar. Hoewel we niet al deze materialen in dit protocol hebben gevalideerd, moedigen we andere onderzoekers aan om de prestaties van nieuwe materialen relatief te analyseren ten opzichte van wat we hier presenteren. We bieden methoden voor het idealiter behouden van weefsel voor verschillende toepassingen in situaties waar LN2 niet kan worden benaderd, bijvoorbeeld wanneer LN2 vervoer niet mogelijk is vanwege toegang tot de site via een klein vliegtuig in de Amazone. Daarnaast bieden we een methode voor het verzamelen van weefsel waaruit levende cellen kunnen worden gekweekt en gekweekt. Hieronder beschrijven we belangrijke overwegingen voor het verzamelen van materiaal voor elk van deze respectieve doeleinden en een overzicht van de inzamelings methoden wordt gegeven in tabel 1.
Weefsel voor DNA
Voor alle verzamelde geoogste weefsels zal de opslagmedia bepalen of het kan worden gebruikt voor DNA-extractie met een standaard of hoog moleculair gewicht (HMW). HMW is vereist voor sequentiëren met lange leesvolgorde en is momenteel vereist voor het genereren van genoom assemblages op chromosoom niveau, of een “Platinum Standard”-genoom. DNA van laag moleculair gewicht (LMW) kan worden geëxtraheerd uit Flash Frozen, AllProtect (hierna “weefsel stabiliserende oplossing” genoemd), of zelfs RNAlater (hierna “RNA stabiliserende oplossing”)-bewaarde monsters (Hoewel Flash Frozen samples optimaal blijven ). DNA geïsoleerd door standaard laboratoriummethoden (bijvoorbeeld silicagel membraan spin kolommen, fenol-chloroform), kan nog steeds DNA-fragmenten van tot ~ 20 kilo bases (KB) opleveren. Daarom, mits er voldoende opbrengst is, kan deze vorm van geïsoleerd DNA worden gebruikt voor de voorbereiding van de bibliotheek met één wisselplaatgrootte, waarbij de wisselplaatgrootte vaak ~ 500 base-pairs (BP) is en korte reeks leesbewerkingen van ~ 100 BP worden gegenereerd12. Dit DNA is vooral nuttig voor “resequencing”-projecten of studies waarbij volledige chromosomen gegevens niet nodig zijn. HMW-DNA (10-150 KB) is uitdagender en kan alleen betrouwbaar worden verkregen met behulp van weefsel dat snel is bevroren in LN2 na de oogst en gehandhaafd bij een maximum van-80 °C tot extractie.
Laag moleculair gewicht of gefragmenteerd DNA is vaak voldoende voor gerichte benaderingen, met inbegrip van genamplificatie via PCR en short-Read sequencing13. PCR-gebaseerde onderzoeken waarbij gebruik wordt gemaakt van lmw-DNA dat slechts één of enkele genen target, zijn zeer informatief in het begrijpen van adaptatie en de moleculaire evolutie van de BBT-sensorische biologie6,14, fysiologie15, fylogenetica 5,16en conservatie17,18. Voor talrijke gewervelde groepen, waaronder vleermuizen19, is ook gebleken dat een succesvolle reeks van laag moleculair gewicht en GEFRAGMENTEERD DNA is getarget. Deze methoden zijn vaak kosteneffectief en minimaal invasief voor de vleermuis, als fecale monsters en niet-dodelijke weefsel bemonstering via buccale doekjes of Wing biopsie stoten zijn ook gemeenschappelijke manieren om DNA te verkrijgen voor analyses met een laag moleculair gewicht20, 21.
De kwaliteit is echter sterk afhankelijk van het type media waarin het monster is opgeslagen22. Na systematische en kwantitatieve vergelijkingen van buccale doekjes en biopsie stoten, is gebleken dat Wing biopsie ponsen consistent hogere niveaus van DNA opleveren en minder belastend waren voor de vleermuis tijdens collectie22. Deze vergelijkingen toonden ook aan dat de beste resultaten werden verkregen toen de vleugel Punch werd bewaard in indicator silica (d.w.z. een type droogmiddel gemaakt van silicagel kralen dat van kleur verandert wanneer vocht wordt waargenomen) in plaats van in andere populaire opslagmedia zoals ethanol of DMSO22; Hoewel, andere opslagmedia met inbegrip van weefsel stabilisatie oplossing werden niet onderzocht. Vleugel stoten kan ook worden gebruikt om fibroblast cellen in cultuur te kweken, zoals in Kacprzyk et al.23 en zoals hieronder beschreven (zie rubriek 6). Voor deze methoden moet de vleugel of uropatagium voorzichtig worden verlengd, en moet een schone biopsie Punch, meestal 3 mm in diameter, worden gebruikt om het monster te verkrijgen. Deze aanpak lijkt te leiden tot geen blijvende schade, met littekens genezing over binnen weken in de meeste gevallen24.
HMW-DNA (10-150 KB) is uitdagender en wordt momenteel alleen betrouwbaar verkregen met behulp van weefsel dat snel is bevroren in LN2 na de oogst en gehandhaafd bij een maximum van-80 °C tot extractie. HMW DNA (10-150 KB) is cruciaal voor het lang lezen van DNA-sequencing en dus voor de Novo genoome assembly. Inderdaad, terwijl de meeste commerciële kits kunnen worden gebruikt om een standaard HMW-DNA te isoleren, voldoen de resulterende molecuul grootten vaak niet aan de vereisten van de derde generatie sequentie technologieën [bijv. die worden gelanceerd door bedrijven zoals Pacific Biosciences (PacBio), Oxford Nanopore Technologies, en 10x Genomics, of door middel van assemblage methoden aangeboden door Bionano Genomics of Dovetail Genomics]. Als zodanig is er een nieuwe vraag naar “Ultra HMW” DNA (> 150 KB). Bij het verkrijgen van ultra HMW DNA van vleermuizen, verse monsters van de lever, hersenen, of spier zijn allemaal geschikt, maar deze moeten onmiddellijk Flash bevroren in LN2 zonder opslag buffer of cryoprotectant. Een volledige beschrijving van deze stappen valt buiten het bestek van dit document, maar is elders beschikbaar25.
Weefsel voor RNA
RNA is een enkel-streng molecuul dat minder stabiel is dan DNA. Hoewel er vele vormen van RNA,-omics analyses hebben de neiging om zich te concentreren op mRNA (boodschapper RNA) en kleine Rna’s (bv, microRNAs). Na transcriptie wordt de mRNA gesplitst om een volwassen transcript te vormen die geen intron bevat en het coderings gedeelte van genen/Genomes vertegenwoordigt. Codeer genen zijn voor een kleine fractie van de genoom grootte (1%-2%), waardoor het doel van mRNA een kosteneffectieve manier is om sequentie gegevens voor genen te verkrijgen. Microrna’s zijn een klasse van Rna’s die het vertaalproces van mRNA in eiwitten reguleren en dus belangrijke regelgevende Effectors zijn. RNA transcripten kunnen afzonderlijk worden geordend, of meer algemeen voor-omics analyses26,27,28,29,30, als onderdeel van een transcriptome; dat is, het totaal van alle RNA transcripten aanwezig in een bepaald monster.
Sequentiëren kan worden uitgevoerd volgens verschillende methoden (d.w.z. via kortlees-RNA-SEQ of lange-lees hele isovorm SEQ), waardoor analyse van zowel RNA-overvloed als isovorm-gebruik mogelijk is. Aangezien de hoeveelheid en de diversiteit van mRNA-transcripten varieert tussen cellen en weefsels, maakt RNA-sequencing het mogelijk om genexpressie en regulering over monsters te bestuderen en te vergelijken. Belangstelling voor het sequentiëren van kleine rna’s en volledige isovorm-sequencing groeit, omdat deze methoden steeds meer biologisch informatief worden. Voorbereiding van weefselmonsters om verschillende klassen van RNA te sequenties kan op dezelfde manier worden uitgevoerd als in dit manuscript, met alleen de daaropvolgende extractiemethoden die verschillen van31,32. Ten slotte, omdat transcriptomes een hoge dekkings subset van het genoom met eiwit codering bieden, kan de verzamelde gegevensset nuttig zijn bij genoom assemblage en aantekening, waardoor het verzamelen van RNA-SEQ-gegevens over een reeks verschillende weefsels een belangrijk onderdeel van de Bat1K Initiative.
In tegenstelling tot DNA is RNA chemisch instabiel en ook doelwit van RNase-enzymen, die alomtegenwoordig aanwezig zijn in weefsel lysaten als een defensieve strategie tegen RNA-gebaseerde virussen. Om deze redenen begint de RNA-Fractie in cellen en weefsels kort na het punt van bemonstering en/of euthanasie te degraderen. Het behoud van het RNA vereist daarom stappen om de afbraak ervan te voorkomen. Dit impliceert meestal het behoud van vers ingezameld weefsel bij 4 °C in een stabiliserend middel zoals RNA stabiliserende oplossing om de Rnasen van nature aanwezig in weefsels te inactiveren, gevolgd door bevriezing voor langere termijn opslag. Als een voorkeur alternatief, weefsel kan worden Flash bevroren in LN2; Hoewel zoals hierboven vermeld, kan het transporteren van LN2 in het veld en het onderhouden van niveaus om te voorkomen dat het weefsel ontdooien logistisch uitdagend zijn.
Weefsel voor eiwitten
Eiwit samenstelling en relatieve overvloed variëren tussen cellen en weefsels op een vergelijkbare manier als wat werd besproken voor RNA; echter, eiwitten zijn gemiddeld stabieler dan RNA. Eiwit identificatie met behulp van proteomica komt meestal overeen met een fractie van, en niet de hele, eiwitsequentie, maar het kan informatie over de expressie over weefsels leveren en de aanwezige pathogenen karakteriseren. Aangezien veel eiwit sequenties over zoogdieren worden bewaard, kunnen BBT-monsters voor proteomica gemakkelijk worden verontreinigd met geconmaineerde menselijke eiwitten, waarbij steriele protocollen (bijv. handschoenen, Tang) nodig zijn tijdens het verzamelen. Terwijl het flitsen in LN2 de beste manier is om de afbraak van eiwitten te voorkomen, is het gebruik van droogijs,-20 °C vrieskisten en zelfs ijs geschikt als er geen andere middelen zijn. Naarmate de temperaturen toenemen, stijgt ook het risico van differentiële eiwitafbraak. Stabiliserend middelen zoals weefsel stabilisatie oplossing zijn effectief in het behoud van de eiwitfractie van weefsels bij kamertemperatuur en zijn geschikt voor kortstondig behoud (tot een week) wanneer het invriezen van de vlam niet haalbaar is.
Het enzymatische Profiel van een bepaald weefsel beïnvloedt direct het behoud van eiwitten daarin. Weefsels met een lage enzymatische activiteit zoals spier kunnen eiwit profielen behouden, zelfs bij de hogere temperaturen in een huishoudelijke vriezer. Daarentegen is leverweefsel enzymatisch reactief, en zijn eiwitten hebben hogere waarschijnlijkheden van vernederende tijdens de bereiding. Het groeiend aantal protocollen voor het verkrijgen van menselijke proteomische profielen uit formalin-Fixed paraffine-embedded (FFPE)-monsters suggereert dat Paraformaldehyde-fixatie van weefsels een belofte voor laaggeprijsde eiwit conservering bevat wanneer het invriezen niet wordt haalbaar33,34. Hoewel sterk afhankelijk van behoud tijd en conditie, zijn eiwitten geïdentificeerd via Immunohistochemie van formalin-vaste, met ethanol geconserveerde vleermuis specimens35. Deze aanpak is niet schaalbaar tot monsterneming op Proteomic-niveau, maar benadrukt het potentieel voor formalin-Fixed bat-weefsels om eiwit profielen te leveren wanneer het invriezen niet beschikbaar is en andere stabiliserend middelen te kostbaar zijn.
Weefsel voor celkweek
Monsternemings weefsel en flits bevriezing bieden een eindige hoeveelheid materiaal dat moet worden gebruikt en zodra het materiaal wordt gebruikt, is het niet meer beschikbaar. Celculturen bieden ook levende cellen die onmiddellijk kunnen worden gebruikt of bewaard voor toekomstige studies. Culturen vergemakkelijken ook de expansie van cellen om de opbrengst te verhogen wanneer weefselmonsters klein zijn. Het is vooral nuttig in gevallen waarin weefsel inzameling beperkt is, zoals experimenten met zeldzame soorten waarin niet-dodelijke bemonstering essentieel is en daarom grote gevolgen heeft voor de instandhouding. Beschreven is een protocol waarin celcultuur mogelijk is via niet-dodelijke bemonstering van vleugel membraan weefsel, maar kweek is mogelijk met meerdere weefsel typen36,37. Het protocol dat hier wordt geleverd, selecteert de cellen die zich bevinden. De combinatie van bron weefsel en groeimedia gebruikt maakt dit protocol geschikt voor het selecteren en groeien van fibroblasten, maar indien gewenst kunnen alternatieve protocollen worden gebruikt om te selecteren voor andere celtypen. In de context van het Bat1K-project wordt voorspeld dat voor zeldzame en bedreigde soorten, niet-dodelijke bemonstering van vleugel membranen en de uitbreiding van monsters via kweken essentieel is om het volume van DNA te genereren dat nodig is voor de verschillende technologieën die worden gebruikt5 .
Bat Capture
Alle mensen die vleermuizen hanteren, moeten worden getraind door een bat-competente onderzoeker en tegen rabiës worden gevaccineerd met een reeks pre-exposure injecties. Als bitten, een verdere reeks van post-exposure injecties is nog steeds nodig. Standaardmethoden voor het vangen van vleermuizen zijn mist netten (Figuur 1) en harp vallen (Figuur 2). Mist netten worden meestal gebruikt en zijn ideaal voor gebieden met een lage tot matige activiteit, omdat ze de meeste zorg nodig hebben voor het minimaliseren van de BBT-nood. Kleine vleermuizen zijn bijzonder kwetsbaar en kunnen van stress sterven als ze niet snel geneigd zijn. Frequente netto-inspecties minimaliseren bat letsel en sterfte, evenals schade aan het nevel net. Dit detail is belangrijk omdat de juiste weefsel verzameling vereist dat het weefsel vers is, en onjuiste aandacht voor de mist netten in vleermuizen kan leiden tot onnodige sterfte of vroegtijdige sterfte voordat de onderzoeker monsters goed kan verwerken. Omdat verschillende vleermuizen in een harp val kunnen rusten met minimale nood, is deze aanpak ideaal voor gebieden met een hoge vleermuis activiteit, zoals in de buurt van een grot of grote Roost. Gedetailleerde instructies voor de juiste BBT-vastlegging en gegevensverwerking voor het verzamelen van morfologische en demografische informatie zijn beschikbaar in de aanvullende methoden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol dat in dit manuscript wordt besproken, beschrijft de beste bemonsterings praktijken voor verschillende moleculaire analyses van vleermuizen met hoge doorvoer. Alle succesvol-omics studies vereisen weefsel van hoge kwaliteit, maar het bemonsteren van vleermuis weefsel, evenals andere niet-model organismen, komt vaak voor in veldomstandigheden die niet kunnen worden ingesteld op dezelfde normen als die van een gecontroleerde laboratorium instelling. Sampling vindt vaak plaats op afgelegen locaties, met minimal…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Centro de Ecología y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sánchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vásquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruíz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo en Fanny Fernández Melo voor het maken van weefsel collectie in Peru mogelijk. We danken ook alle leden van Grupo Jaragua en Yolanda León voor het maken van weefsel inzameling in de Dominicaanse Republiek mogelijk, evenals aan Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita, en iedereen bij La Selva Biological Research Station in Costa Rica, voor het maken bemonstering mogelijk. We bedanken Ella latten kamp & Lutz Wiegrebe voor toegang en monster collectie van vleugel stoten van Phyllostomus verkleuren vleermuizen voor celkweek generatie. Phyllostomus verkleurde vleermuizen zijn ontstaan uit een broed kolonie in het departement biologie II van de Ludwig-Maximilians-Universiteit in München. Goedkeuring voor het houden en fokken van de vleermuizen werd afgegeven door het district Veterinair Bureau van München. LMD, SJR, KTJD en LRY werden gefinancierd door NSF-DEB 1442142. LMD werd gefinancierd door NSF-DEB 1838273. LRY werd gefinancierd door de NSF-PRFB 1812035. SCV en PD werden gefinancierd door een Max Planck Research Group Award, en een Human Frontiers Science Program (HFSP) Research Grant (RGP0058/2016). SJR, JHTP, en KTJD werden gefinancierd door de Europese Onderzoeksraad (ERC Starting Grant 310482 [EVOGENO]) toegekend aan SJR, ECT werd gefinancierd door de Europese Onderzoeksraad Grant (ERC-2012-StG311000).
Materials
| 1.5 mL Eppendorf Safelock tubes | Fischer Scientific | 10509691 | 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62,554,002 | 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 2 mL cryovials | Thomas Scientific | 1154P75 | cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen |
| 3-mm biopsy punch | Medline | MIL3332 | wing biopsy punch for cell culture |
| 6 well plate | Greiner | 83,392 | Culture vessle |
| Allprotect Tissue Reagent | Qiagen | 76405 | for fecal samples; tissue stabilizing solution |
| Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber | Bio-Rad | 145-0011 | Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad |
| collagenase IV | Stemcell Technologies | 7909 | For dissociation of primary cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | Prevents crystalization of water during freezing of the cells. |
| DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 12491-015 | culture media |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190169 | Balanced salt solution used for washing cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Fischer Scientific | 10270106 | Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells |
| Gentamycin sulfate salt | Sigma Aldrich | G1264-250MG | Antibiotic for culture media |
| Nalgene Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0050 | Freezing container which provides 1°C/min cooling rate |
| PARAFILM | Sigma | P7793 | Wrapping tubes etc for sealing |
| Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x | Invitrogen | 15140130 | Antibiotic for culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water |
| RNAlater | Thermo Fisher | AM7021 | RNA stabilizing solution |
| RNAse away | Genetech | 83931-250mL | breaks down enzymes that lead to RNA degradation |
| Silica gel | Fisher Scientific | 7631-86-9 | dessicant agent |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Automated cell counter |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | Cell stain used to assess cell viability |
| trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 | For dissociation of cells during splitting |
Riferimenti
- Jiao, W. B., Schneeberger, K. The impact of third generation genomic technologies on plant genome assembly. Current Opinion in Plant Biology. 36, 64-70 (2017).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Naquin, D., Thermes, C. The third revolution in sequencing technology. Trends in Genetics. 34 (9), 666-681 (2018).
- Lee, H., et al. Third-generation sequencing and the future of genomics. bioRxiv. , 048603 (2016).
- Mayjonade, B., et al. Extraction of high-molecular-weight genomic DNA for long-read sequencing of single molecules. BioTechniques. 62 (1), xv (2017).
- Teeling, E., et al. Bat biology, genomes, and the Bat1K project: To generate chromosome-level genomes for all living bat species. Annual Review of Animal Biosciences. 6 (12), 1-24 (2018).
- Jones, G., Teeling, E. C., Rossiter, S. J. From the ultrasonic to the infrared: molecular evolution and the sensory biology of bats. Frontiers in Physiology. 4 (117), 1-16 (2013).
- Vincenot, C. E., Florens, F. B. V., Kingston, T. Can we protect island flying foxes. Science. 355 (6332), 1368-1370 (2017).
- Blehert, D. S., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen?. Science. 323 (5911), 227 (2009).
- Foley, J., Clifford, D., Castle, K., Cryan, P., Ostfeld, R. S. Investigating and managing the rapid emergence of White Nose Syndrome, a novel, fatal, infectious disease of hibernating bats. Conservation Biology. 25 (2), 223-231 (2011).
- Foley, N. M., et al. Growing old, yet staying young: The role of telomeres in bats’ exceptional longevity. Science Advances. 4, (2018).
- Dammann, P. Slow aging in mammals—Lessons from African mole-rats and bats. Seminars in Cell and Developmental Biology. 70, 154-163 (2017).
- Tsagkogeorga, G., Parker, J., Stupka, E., Cotton, J. A., Rossiter, S. J. Phylogenomic analyses elucidate the evolutionary relationships of bats. Current Biology. 23 (22), 2262-2267 (2013).
- Rohland, N., Reich, D. C. o. s. t. -. e. f. f. e. c. t. i. v. e. high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Yohe, L. R., et al. Trpc2 pseudogenization dynamics in bats reveal ancestral vomeronasal signaling, then pervasive loss. Evolution. 71 (4), 923-935 (2017).
- Shen, B., Han, X., Zhang, J., Rossiter, S. J., Zhang, S. Adaptive evolution in the glucose transporter 4 gene Slc2a4 in Old World fruit bats (family: Pteropodidae). PLoS ONE. 7 (4), e33197 (2012).
- Rojas, D., Warsi, O. M., Dávalos, L. M. Bats (Chiroptera: Noctilionoidea) challenge a recent origin of extant neotropical diversity. Systematic Biology. 65 (3), 432-448 (2016).
- Vonhof, M. J., Russell, A. L. Genetic approaches to the conservation of migratory bats: a study of the eastern red bat (Lasiurus borealis). PeerJ. 3, e983 (2015).
- Korstian, J. M., Schildt, A. J., Bennett, V. J., Williams, D. A., Hale, A. M. A method for PCR-based identification of bat species from fecal samples. Conservation Genetics Resources. 7 (4), 803-806 (2015).
- Bailey, S. E., et al. The use of museum samples for large-scale sequence capture: A study of congeneric horseshoe bats (family Rhinolophidae). Biological Journal of the Linnean Society. 117 (1), 58-70 (2016).
- Boston, E. S. M., et al. Empirical assessment of non-invasive population genetics in bats: Comparison of DNA quality from faecal and tissue samples. Acta Chiropterologica. 14 (1), 45-52 (2012).
- Puechmaille, S. J., Mathy, G., Petit, E. J. Good DNA from bat droppings. Acta Chiropterologica. 9 (1), 237-249 (2007).
- Corthals, A., et al. From the field to the lab: Best practices for field preservation of bat specimens for molecular analyses. PLoS ONE. 10 (3), 1-12 (2015).
- Kacprzyk, J., Teeling, E. C., Kelleher, C., Volleth, M. Wing membrane biopsies for bat cytogenetics: Finding of 2n = 54 in Irish Rhinolophus hipposideros (Rhinolophidae, Chiroptera, Mammalia) supports two geographically separated chromosomal variants in Europe. Cytogenetic and Genome Research. 148 (4), 279-283 (2016).
- Greville, L. J., Ceballos-Vasquez, A., Valdizón-Rodríguez, R., Caldwell, J. R., Faure, P. A. Wound healing in wing membranes of the Egyptian fruit bat (Rousettus aegyptiacus) and big brown bat (Eptesicus fuscus). Journal of Mammalogy. 99 (4), 974-982 (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 403-414 (2018).
- Shaw, T. I., et al. Transcriptome sequencing and annotation for the Jamaican fruit bat (Artibeus jamaicensis). PLoS one. 7 (11), e48472 (2012).
- Seim, I., et al. Genome analysis reveals insights into physiology and longevity of the Brandt’s bat Myotis brandtii. Nature communications. 4, 2212 (2013).
- Lei, M., Dong, D., Mu, S., Pan, Y. H., Zhang, S. Comparison of brain transcriptome of the greater horseshoe bats (Rhinolophus ferrumequinum) in active and torpid episodes. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Lee, A. K., et al. De novo transcriptome reconstruction and annotation of the Egyptian rousette bat. BMC Genomics. 16 (1), 1-11 (2015).
- Francischetti, I. M. B., et al. The “Vampirome”: Transcriptome and proteome analysis of the principal and accessory submaxillary glands of the vampire bat Desmodus rotundus, a vector of human rabies. Journal of Proteomics. 82, 288-319 (2013).
- Wen, M., et al. Exploring the genome and transcriptome of the cave nectar bat Eonycteris spelaea with PacBio long-read sequencing. GigaScience. (September), 1-8 (2018).
- Gonzalez-Garay, M. L. Introduction to isoform sequencing using pacific biosciences technology (Iso-Seq). Transcriptomics and Gene Regulation. , 141-160 (2016).
- Paulo, J. A., Lee, L. S., Banks, P. A., Steen, H., Conwell, D. L. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded pancreatic tissue using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Pancreas. 41 (2), 175 (2012).
- Wiśniewski, J. R. Proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. (79), (2013).
- Sadier, A., et al. Evidence for multifactorial processes underlying phenotypic variation in bat visual opsins. bioRxiv. , 300301 (2018).
- Sotero-Caio, C. G., et al. Integration of molecular cytogenetics, dated molecular phylogeny, and model-based predictions to understand the extreme chromosome reorganization in the Neotropical genus Tonatia (Chiroptera: Phyllostomidae). BMC Evolutionary Biology. 15 (1), 1-15 (2015).
- Baker, R. J., Hamilton, M. J., Parish, D. A. . Preparations of mammalian karyotypes under field conditions. , (2003).
- Song, H., Buhay, J. E., Whiting, M. F., Crandall, K. A. Many species in one: DNA barcoding overestimates the number of species when nuclear mitochondrial pseudogenes are coamplified. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (36), 13486-13491 (2008).
- Pooniya, S., Lalwani, S., Raina, A., Millo, T., Das Dogra, T. Quality and quantity of extracted deoxyribonucleic Acid (DNA) from preserved soft tissues of putrefied unidentifiable human corpse. Journal of Laboratory Physicians. 6 (1), 31 (2014).
- Camacho-Sanchez, M., Burraco, P., Gomez-Mestre, I., Leonard, J. A. Preservation of RNA and DNA from mammal samples under field conditions. Molecular Ecology Resources. 13, 663-673 (2013).
- Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Current Protocols in Cell Biology. 66 (1), 1 (2015).
- Database, J. S. E. Using a hemacytometer to count cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2018).
- Dávalos, L. M., Velazco, P. M., Warsi, O. M., Smits, P. D., Simmons, N. B. Integrating incomplete fossils by isolating conflicting signal in saturated and non-independent morphological characters. Systematic Biology. 63 (4), 582-600 (2014).
- Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA Integrity Number (RIN)-Standarization of RNA quality control. Nano. , 1-17 (2004).
- Leary, S., et al. . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
- Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post morterm interval. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
- Hecht, A. M., Braun, B. C., Krause, E., Voigt, C. C., Greenwood, A. D., Czirják, G. Plasma proteomic analysis of active and torpid greater mouse-eared bats (Myotis myotis). Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).
- Ball, H. C., Levari-Shariati, S., Cooper, L. N., Aliani, M. Comparative metabolomics of aging in a long-lived bat: Insights into the physiology of extreme longevity. PLoS ONE. 13 (5), 1-20 (2018).
- Kacprzyk, J., et al. A potent anti-inflammatory response in bat macrophages may be linked to extended longevity and viral tolerance. Acta Chiropterologica. 19 (2), 219-228 (2017).
- Littlefair, J. E., Clare, E. L. Barcoding the food chain: from Sanger to high-throughput sequencing. Genome. 59 (11), 946-958 (2016).
- Phillips, C. D., et al. Microbiome analysis among bats describes influences of host phylogeny, life history, physiology and geography. Molecular Ecology. 21 (11), 2617-2627 (2012).
- Carrillo-Araujo, M., et al. Phyllostomid bat microbiome composition is associated to host phylogeny and feeding strategies. Frontiers in Microbiology. 6 (May), 1-9 (2015).
- Hughes, G. M., Leech, J., Puechmaille, S. J., Lopez, J. V., Teeling, E. C. Is there a link between aging and microbiome diversity in exceptional mammalian longevity?. PeerJ. 6, e4174 (2018).
- Pannkuk, E. L., et al. Fatty acid methyl ester profiles of bat wing surface lipids. Lipids. 49 (11), 1143-1150 (2014).
- Pannkuk, E. L., et al. Glycerophospholipid profiles of bats with white-nose syndrome. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (4), 425-432 (2015).
