אוסף רקמות של עטלפים עבור-ניתוח Omics ותרבות התא הראשוני
Summary
זהו פרוטוקול עבור הכנת רקמה אופטימלית עבור גנומית, טראנסקריפט, וניתוחים פרוטאומית של עטלפים נתפס בטבע. הוא כולל פרוטוקולים עבור לכידת בת וניתוח, שימור רקמות, ותא culturing של רקמת בת.
Abstract
כמו טכנולוגיות ברצף התפוקה גבוהה מראש, שיטות סטנדרטיות לרכישת רקמות באיכות גבוהה ושימור לאפשר הארכה של שיטות אלה לאורגניזמים שאינם מודל. סדרה של פרוטוקולים כדי למטב את אוסף רקמות מעטלפים פותחה עבור סדרה של גישות בתפוקה גבוהה רצף. מתוארים כאן הם פרוטוקולים ללכידת עטלפים, הדמוגרפיה הרצויה לאסוף עבור כל עטלף, ואת שיטות אופטימיזציה כדי למזער את הלחץ על המחבט במהלך איסוף רקמות. מתואר במיוחד הם שיטות איסוף וטיפול ברקמות כדי להשיג (i) DNA עבור משקל מולקולרי גבוה ניתוחים גנומית, (ii) RNA עבור הרקמה ספציפיים הטרנססקריפט, ו (iii) חלבונים עבור ניתוח ברמה פרוטמית. לבסוף, גם מתואר הוא שיטה כדי למנוע דגימה קטלנית על ידי יצירת תרביות תאים הראשי קיימא מאטבי כנף. מוטיבציה מרכזית של שיטות אלה היא למקסם את כמות הנתונים המולקולריים הפוטנציאליים ומורפולוגיים עבור כל עטלף ולהציע דרכים אופטימליות כדי לשמר את הרקמות כך שהם שומרים על הערך שלהם כמו שיטות חדשות להתפתח בעתיד. סטנדרטיזציה זו הפכה חשובה במיוחד כמו יוזמות לרמת כרומוזום ברמה, שגיאה ללא שגיאות של מינים ברחבי העולם הופיעו, שבו מפלגות מדעיות מרובות מוביל את רצף של מיסים שונים קבוצות. הפרוטוקולים המפורטים להלן מגדירים את אוסף הרקמה האידיאלית שיטות שימור רקמה עבור Bat1K, קונסורציום כי הוא ברצף את הגנום של כל מיני עטלף.
Introduction
שיטות של רצף תפוקה גבוהה (HTS) מתקדמות במהירות ביעילות ומוקטנת בעלות, וכעת ניתן לשנות את הגישות למאות או לאלפי דגימות. תובנות המתקבלות על ידי יישום של טכנולוגיות אלה יש השפעות עצומות על פני דיסציפלינות מדעיות מרובות, מ ביודינין לאבולוציה ואקולוגיה1,2,3. עם זאת, יישומים רבים HTS להסתמך באופן ביקורתי על חומצות גרעין באיכות גבוהה ממקור חי. מגבלה זו עשויה להיות בעייתית יותר ויותר עם התפתחות רצף הדור השלישי על בסיס מולקולות לקרוא ארוך4. מסיבות אלה, יש צורך למקד את המאמצים על הקמת שיטות העבודה הטובות ביותר לאיסוף דגימות רקמה טרייה מאורגניזמים בר מחוץ למעבדה, אשר מגדיל את כלי השירות של החומר ומפחית את מספר האנשים שצריכים להיות נאסף.
Bat1K הוא קונסורציום בינלאומי של מדענים עם יוזמה מתמשכת לרצף את הגנום של כל מיני עטלף להרכבה ברמת כרומוזום5. העטלפים מייצגים 20% ממגוון היונקים ומצטיינים בעיבודים יוצאי דופן בעלי השלכות להבנת ההזדקנות, אקולוגיה של מחלות, ביולוגיה חושית וחילוף חומרים5,6. עטלפים רבים גם איימו או בסכנת הכחדה בשל ניצול האדם7 או מתדרדר במהירות בשל פתוגנים8,9, ואת רצף ברמת הגנום הוא בעל חשיבות רבה לשימור מינים אלה. למרות Bat1K כיום מטרתו לרצף את הגנום של כל מיני העטלף, את הסטנדרטיזציה של אוסף דגימות של רקמה לרצף גנומית באיכות גבוהה נשאר אתגר מפתח על פני הקהילה של ביולוגים אורגאימאל. בנוסף נתונים גנומית, הבנה פונקציונלית של מגוון של עיבודים בת דורש ניתוח ספציפי לרקמות הטרנס והחלבונים, לעתים קרובות דורשים פרוטוקולים אוסף נפרד. יתרה מזאת, כמו בכל הקבוצות המטקיות, בעוד שאוסף הרקמה האופטימלי והשימור חיוני להשגת הנתונים באיכות הגבוהה ביותר עבור ניתוח omics, התקשורת הטובה ביותר היא לעתים קרובות קשה בגלל טכנולוגיות משתנות במהירות ו צוותי מחקר מרובים עובדים באופן עצמאי.
הצורך לאמץ את השיטות הטובות ביותר עבור מחקר בת-omics דחוף במיוחד, בהתחשב בכך שמינים רבים של עטלפים הם נדירים או מאוימים. בניגוד ליונקים קטנים אחרים כגון מכרסמים ושיני, עטלפים הם ארוכים, המיוחס מנגנוני תיקון DNA יוצא דופן10 ו הרבייה איטית11, עם רוב המינים ללדת רק אחד או (במקרים מעטים) שני צעירים בשנה. מסיבות אלו, אוכלוסיית העטלף יכולה להיות איטית כדי להתאושש מהפרעה, ואיסוף אנשים רבים מן הטבע אינו מומלץ ולא ניתן לביצוע. במילים אחרות, על הפרוטוקולים להיות ממוטבים כדי לקבל את הכמות המרבית של נתונים עבור דגימה בודדת, ובכך לצמצם את הצורך לשכפל את מאמצי הדגימה שלא לצורך.
כאן, פרוטוקול זה מתמקד במיוחד על שיטות סטנדרטיות עבור אוסף ודגימה של רקמת בת עבור הרצף הגנומית וניתוח החלבונים הטרנססקריפט. העדיפות העליונה שלה היא להבטיח כי רקמות העטלף נאספים מבחינה אתית ובאחריות, החל בתהליך המתיר עבור האוסף, ייצוא של רקמות למזעור הלחץ לבעלי חיים, ותנאי אחסון ארוכי טווח. ניתוח משוכלל פותחו במטרה לקבל בעתיד את התועלת של חומרים שונים שנאספו. כתב יד זה מספק מדריך צעד-אחר-צעד לאיסוף עטלפים באופן אנושי שנועד למזער את ההשפעה על אוכלוסיות ולמקסם את הערך המדעי. בעוד המיקוד של פרוטוקול זה הוא במיוחד לשימוש בעטלפים, רבים מהשלבים רלוונטיים אחרים בעלי חוליות, בעיקר יונקים.
סקירה כללית של אוסף הרקמה
ההליך לאיסוף רקמות, כולל הטמפרטורה לאחסון ובחירת הסוכן, ייקבע על-ידי האופי של כל ניתוח במורד הזרם המתוכנן. עם זאת, מומלץ מאוד כי, כאשר הדבר אפשרי, הרקמה נאסף תחת מגוון של שיטות כדי למקסם את השירות העתידי שלה גם אם לא מתוכננת ניתוח מסוים. באופן כללי, רקמות נאסף ונשמר לניתוחים הבאים של חומצות גרעין (DNA ו-RNA), או חלבון. עבור כל אחד מהיישומים הללו, רקמות ניתן לשמור באופן אופטימלי על ידי הקפאת פלאש ישירות בחנקן נוזלי (LN2). עם זאת, טבילה מיידית ב LN2 לא תמיד אפשרי בתחום. כמו התקדמות הטכנולוגיה, משאבים כגון מבחנות מיוחדות כדי לאחסן DNA ו-RNA בטמפרטורות הסביבה הופכים לזמינים יותר. למרות שלא הצלחנו לממש את כל החומרים הללו בפרוטוקול זה, אנו מעודדים חוקרים אחרים לנתח באופן יחסי את הביצועים של חומרים חדשים ביחס למה שאנו מציגים כאן. אנו מספקים שיטות כדי לשמר את הרקמה האידיאלית עבור יישומים שונים במצבים שבהם LN2 לא ניתן לגשת, לדוגמה, כאשר LN2 התחבורה אינה אפשרית בשל גישה לאתר באמצעות מטוס קטן באמזונס. בנוסף, אנו מספקים שיטה לאיסוף רקמות שמהן ניתן לגדל ולהפיץ תאים חיים. להלן מתווה שיקולים מרכזיים לאיסוף חומר עבור כל אחד מהמטרות הללו וסקירה של שיטות הגבייה ניתנת בטבלה 1.
רקמת דנ א
עבור כל הרקמה שנאספה שנאספו, מדיית האחסון תקבע אם ניתן להשתמש בו עבור או משקל מולקולרי רגיל או גבוה (HMW) חילוץ DNA. HMW נדרש ברצף ארוך לקרוא וכרגע נדרש כדי ליצור הרכבות הגנום ברמת כרומוזום, או הגנום “רגיל” פלטינה. משקל מולקולרי נמוך (LMW) DNA ניתן לחלץ הבזק קפוא, AllProtect (מעתה המכונה “פתרון ייצוב רקמות”), או אפילו RNAlater (מעתה ואילך “RNA ייצוב פתרון”)-דגימות שנשמרו (למרות פלאש קפוא דגימות להישאר אופטימלי ). ה-DNA מבודד על ידי שיטות מעבדה סטנדרטית (למשל, סיליקה ג’ל ממברנה ספין עמודות, פנול-כלורופורם), יכול עדיין להניב שברי דנ א של עד ~ 20 קילו (kb). לכן, בתנאי יש תשואה מספקת, צורה זו של ה-DNA מבודדים ניתן להשתמש עבור הוספת גודל הספרייה בודדת, שבו גודל ההכנסה הוא לעתים קרובות ~ 500 בסיס זוגות (bp), ומקריא רצף קצר של ~ 100 bp נוצרות12. ה-DNA הזה שימושי במיוחד לפרויקטים של “סידור מחדש” או למחקרים שבהם נתונים כרומוזומטיים באורך מלא אינם נדרשים. HMW DNA (10-150 kb) הוא מאתגר יותר יכול להיות רק מושגת באופן אמין באמצעות רקמה כי כבר פלאש מהיר קפוא ב LN2 בעקבות הקציר ומתוחזק במקסימום של-80 ° צ’ עד החילוץ.
משקל מולקולרי נמוך או דנ א מפוצל הוא לעתים קרובות מספיק גישות ממוקדות, כולל הגברה גנטית דרך ה-PCR ולקרוא ברצף13. PCR מבוססי חקירות באמצעות ה-DNA lmw כי היעד רק אחד או כמה גנים היו אינפורמטיבי מאוד בהבנת הסתגלות ואת האבולוציה המולקולרית של בת ביולוגיה חושית6,14, פיזיולוגיה15, פילוגנטיקה 5,16, ושימור17,18. רצף ממוקד מוצלח לשחזר של משקל מולקולרי נמוך ו-DNA מפוצל הוכח גם עבור קבוצות בעלי חוליות רבות, כולל עטלפים19. שיטות אלה הן לעתים קרובות חסכונית ומינימלית פולשנית למחבט, כמו דגימות צואה ודגימת רקמה שאינה קטלנית באמצעות מטליות בוצ או אגרופים כנף הם גם דרכים נפוצות להשיג דנ א עבור משקל מולקולרי נמוך ניתוח20, . עשריםואחד
עם זאת, האיכות תלויה במידה רבה בסוג המדיה שבה מאוחסן המדגם22. לאחר השוואות שיטתית וכמותי של בדיקות ואגרופים ביופסיה, אגרופים כנף ביופסיה הוכחו להניב רמות גבוהות יותר של DNA ו היו פחות מלחיץ את המחבט במהלך אוסף22. השוואות אלה גם הראו כי התוצאות הטובות ביותר התקבלו כאשר פונץ ‘ כנף השתמר סיליקה אינדיקטור (כלומר, סוג של התייבשות עשוי חרוזי סיליקה ג’ל המשתנה צבע כאשר הלחות נצפתה) ולא באמצעי אחסון פופולריים אחרים כגון אתנול או DMSO22; למרות, אמצעי אחסון אחרים כולל פתרון ייצוב רקמות לא נבדקו. ניתן להשתמש באגרופים בכנף גם כדי לגדל תאים העשויים בתרבות, כמו בקצ’יק ואח ‘23 וכמתואר להלן (ראה סעיף 6). עבור שיטות אלה, הכנף או uropatagium צריך להיות מורחב בעדינות, ואת האגרוף ביופסיה נקי, בדרך כלל 3 מ”מ בקוטר, יש להשתמש כדי להשיג את המדגם. גישה זו מופיעה לגרום נזק לא מתמשך, עם צלקות ריפוי בתוך שבועות ברוב המקרים24.
ה-DNA HMW (10-150 kb) הוא מאתגר יותר וכרגע רק מושגת באופן אמין באמצעות רקמה כי כבר פלאש מהיר קפוא ב LN2 בעקבות הקציר ומתוחזק במקסימום של-80 ° צ’ עד החילוץ. ה-DNA HMW (10-150 kb) הוא חיוני עבור רצפי דנ א ארוך לקרוא ולכן עבור הרכבת דה נובו הגנום. אכן, בעוד ערכות מסחריות ביותר ניתן להשתמש כדי לבודד את ה-DNA סטנדרטי HMW, מידות המולקולה שנוצר לעתים קרובות לא עומדים בדרישות של הדור השלישי ברצף טכנולוגיות [g., אלה השיקה על ידי חברות כגון פסיפיק ביומדעים (PacBio), אוקספורד Nanopore טכנולוגיות, ו-10x גנומיקה, או באמצעות שיטות הרכבה המוצעים על ידי ביונאנו גנומיקה או בהגנומיקה. ככזה, קיימת דרישה חדשה ל-DNA “אולטרה HMW” (> 150 kb). בעת קבלת ה-DNA ultra HMW מן העטלפים, דגימות טריות של הכבד, המוח, או השריר מתאימים כולם, אבל אלה חייבים להיות מיד פלאש קפוא ב LN2 ללא כל מאגר אחסון או כימיות. תיאור מלא של שלבים אלה הוא מעבר לטווח של הנייר הזה אבל הם זמינים במקומות אחרים25.
רקמת רנ א
רנ א היא מולקולה בודדת תקועים כי הוא פחות יציב מ-DNA. למרות שיש צורות רבות של RNA,-מנתח omics נוטים להתמקד mRNA (שליח RNA) ו RNAs קטן (למשל, microRNAs). לאחר תמלול, mRNA משולבים כדי ליצור תעתיק בוגר שאינו מכיל introns ומייצג את החלק קידוד של גנים/genomes. קידוד גנים חשבון עבור חלקיק זעיר של גודל הגנום (1%-2%), ביצוע מיקוד mRNA אמצעי יעיל להשגת נתוני רצף עבור גנים. MicroRNAs הם מחלקה של RNAs המסדירים את תהליך התרגום של mRNA לחלבונים, ולכן הם משתמשים ברגולציה חשובה. RNA התעתיקים יכול להיות ברצף בנפרד, או בדרך כלל לניתוחים שבדרך-omics26,27,28,29,30, כחלק מהמרה; כלומר, סך כל התעתיקים של RNA הנמצאים במדגם נתון.
רצף ניתן לבצע בעקבות מספר שיטות (כלומר, באמצעות קצר לקרוא RNA-seq או ארוך לקרוא בשלמותו isoform), המאפשר ניתוח של שניהם השפע RNA ו isoform השימוש. כמו כמות וגיוון של התעתיקים mRNA משתנה בין תאים ורקמות, רצפי RNA מאפשר ללמוד ולהשוות ביטוי גנים ורגולציה על פני דגימות. עניין ברצף RNAs קטן ורצף איזוטופס שלם גדל, כמו שיטות אלה נעשים יותר ויותר אינפורמטיבי ביולוגית. הכנת דגימות רקמות למחלקות שונות של RNA ניתן לבצע באותו אופן כפי שהוצג בכתב יד זה, עם רק שיטות החילוץ הבאות שונות31,32. לבסוף, מכיוון transcript להציע מערכת כיסוי גבוהה של הגנום קידוד חלבון, הנתונים התאספו עשוי להיות שימושי הרכבה הגנום וביאור, ביצוע אוסף של נתוני RNA-seq על פני מגוון של רקמות שונות מרכיב חשוב של . יוזמה Bat1K
בניגוד ל-DNA, ה-RNA הוא לא יציב כימית ממוקד גם על ידי אנזימים RNase, אשר הנוכחי אוביקוויטים ברקמות לlysates כאסטרטגיה הגנתית נגד RNA מבוססי וירוסים. מסיבות אלה, שבר RNA בתאים ורקמות מתחיל לבזות זמן קצר לאחר נקודת הדגימה ו/או המתת חסד. השמירה על RNA ולכן דורשת צעדים כדי למנוע את ההשפלה שלה. זה כרוך בדרך כלל שימור רקמות שנאספו טרי ב 4 ° c בסוכן ייצוב כגון RNA מייצב פתרון כדי להשבית את RNases באופן טבעי הנוכחי ברקמות, ואחריו הקפאה לאחסון ארוך טווח. כחלופה המועדפת, רקמות יכול להיות הבזק קפוא ב LN2; למרות כאמור לעיל, הובלת LN2 לתוך השדה ושמירה על רמות כדי למנוע את הרקמה הרקמות יכול להיות מאתגרת לוגיים.
רקמת חלבון
הרכב החלבון והשפע היחסי משתנים בין תאים ורקמות באופן דומה למה שנדון עבור RNA; עם זאת, חלבונים הם בממוצע יציבה יותר מאשר RNA. זיהוי חלבונים באמצעות פרוטאומניקס בדרך כלל מתאים לשבריר של, ולא את כל החלבונים ברצף, אבל זה יכול לספק מידע על הביטוי על פני רקמות ואפיון פתוגנים נוכח. כמו רצפי חלבונים רבים נשמרים על פני יונקים, העטלף דגימות עבור פרוטאומניקס יכול בקלות להיות מזוהם עם חלבונים אנושיים שימור, דרישת פרוטוקולים סטרילי (g., כפפות, מלקחיים) במהלך האיסוף. בעוד הקפאת הבזק ב LN2 היא הדרך הטובה ביותר למנוע השפלה של חלבונים, שימוש בקרח יבש, 20 ° c מקפיאים, ואפילו קרח מתאימים אם אין אמצעים אחרים. ככל שהטמפרטורות מגדילות, גם הסיכון להתמוטטות החלבון הדיפרנציאלי עולה. ייצוב סוכנים כגון פתרון ייצוב רקמות יעילים בשימור שבריר החלבון של רקמות בטמפרטורת החדר ומתאימים לשימור לטווח קצר (עד שבוע אחד) כאשר הקפאת פלאש אינו בר קיימא.
הפרופיל האנזימטי של רקמה נתונה משפיע ישירות על שימור החלבון שבו. רקמות עם פעילות אנזימטית נמוכה כגון שריר יכול לשמר פרופילי חלבונים אפילו בטמפרטורות גבוהות יותר במקפיא ביתי. לעומת זאת, רקמת הכבד היא תגובתי אנזימקטיבית, והחלבונים שלו יש הסתברות גבוהה יותר של משפיל במהלך ההכנה. מספר גדל והולך של פרוטוקולים להשגת פרופילים פרוטמית אנושיים מ-formalin קבוע-מוטבע-פרפין (FFPE) דגימות מציע כי התיקון פאראפורמלדהיד של רקמות מחזיקה הבטחה לשימור בעלות נמוכה חלבון כאשר הקפאת על איסוף אינו ריאלי33,34. למרות מאוד תלוי בזמן ובמצב השימור, חלבונים זוהו באמצעות אימונוהיסטוכימיה מ-formalin קבוע, האתנול שהשתמרו דגימות העטלף35. גישה זו אינה מדרגית כדי פרוטמית ברמה הדגימה אבל מדגיש את הפוטנציאל formalin-ברמת רקמות קבוע להניב פרופילי חלבון כאשר הקפאת פלאש אינו זמין וסוכני ייצוב אחרים יקרים מדי.
רקמה לתרבית תאים
רקמת הדגימה והקפאת הבזק מציעים כמות מוגבל של חומר לשימוש, וברגע שהחומר משמש, הוא אינו זמין עוד. לחילופין, תרביות תאים מספקות תאים חיים שניתן להשתמש בהם באופן מיידי או להישמר למחקרים עתידיים. תרבויות גם להקל על התרחבות של תאים כדי להגדיל את התשואה כאשר דגימות רקמות קטנות. היא שימושית במיוחד במקרים בהם אוסף רקמות מוגבל, כגון ניסויים עם מינים נדירים שבהם הדגימה הלא קטלנית היא חיונית ולכן יש השלכות רחבות לשימור. תיאר הוא פרוטוקול שבו תרבות התא אפשרית באמצעות דגימה שאינה קטלנית של רקמת ממברנה כנף, אבל culturing אפשרי עם מספר סוגי רקמות36,37. הפרוטוקול שסופק כאן בוחר עבור תאים חסיד. השילוב של רקמות המקור ומדיית הגדילה המשמשים את הפרוטוקול הזה מתאים לבחור ולצמוח, אך אם תרצה, ניתן להשתמש בפרוטוקולים חלופיים כדי לבחור עבור סוגי תאים אחרים. בהקשר של פרויקט Bat1K, הוא ניבא כי עבור מינים נדירים ומאוימים, דגימה שאינה קטלנית של ממברנות כנף והתרחבות של דגימות דרך culturing היא חיונית כדי ליצור את נפח ה-DNA הדרושים עבור טכנולוגיות מרובות המועסקים5 .
לכידת בת
כל האנשים המטפלים בעטלפים צריכים להיות מאומנים על ידי חוקר עטלף מוכשר וחוסנו נגד כלבת עם סדרה של זריקות טרום חשיפה. אם ננשך, סדרה נוספת של זריקות לאחר חשיפה עדיין הכרחי. שיטות סטנדרטיות ללכידת עטלפים כוללות רשתות ערפל (איור 1) ומלכודות נבל (איור 2). רשתות הערפל משמשות בדרך כלל ואידיאליות לאזורים בעלי פעילות נמוכה עד בינונית, שכן הם דורשים את הטיפול הטוב ביותר לצמצום מצוקת העטלף. עטלפים קטנים פגיעים במיוחד ועלולים למות מלחצים אם לא נטו במהירות. בדיקות נטו תכופות ממזער את פגיעת העטלף ואת התמותה, כמו גם נזק לרשת הערפל. פרט זה חשוב כי אוסף הרקמה הנכונה דורש את הרקמה להיות רענן, ותשומת לב לא נאותה לרשתות הערפל בעטלפים יכול להוביל לתמותה מיותרת או תמותה מוקדמת לפני החוקר יכול לעבד כראוי דגימות. בגלל שכמה עטלפים יכולים לנוח במלכודת נבל עם מצוקה מינימלית, גישה זו אידיאלית לאזורים עם פעילות במחבט גבוהה, כגון ליד מערה או מקום גדול. הנחיות מפורטות עבור לכידת המחבט הנכון עיבוד נתונים עבור אוסף של מידע מורפולוגיים ודמוגרפיים זמינים בשיטות המשלים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הנדון בכתב יד זה מתאר את נוהלי הדיגום הטובים ביותר לניתוח מולקולרי בתפוקה גבוהה של עטלפים. כל מחקרים מצליחים-omics דורשים רקמה באיכות גבוהה, אבל רקמת העטלף, כמו גם אחרים שאינם מודל אורגניזמים, מתרחשת לעתים קרובות בתנאי שדה, כי לא ניתן להגדיר את אותם סטנדרטים כמו אלה של הגדרת מעבדה מ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים סנטרו de Ecología y Biodiversidad CEBIO, אריקה פעליזה, מילסקה סנצ’ז, חורחה קאררה, אדגר Rengifo Vásquez, הרולד Porocarrero Zarria, חורחה Ruíz Leveau, חיימה פצ’קו קסטילו, קרלוס Tello, פאני קרניות, ו פאני פראנדס מלו להכנת רקמות קולקציה בפרו אפשרית. כמו כן, אנו מודים לכל חברי גריפו ג’אגואה ויולנדה לאון על הכנת אוסף רקמות ברפובליקה הדומיניקנית, כמו גם לברnal רודריגז הרננדז, ברנל מאטאריטה, וכולם בתחנת המחקר הביולוגית לה סלבה בקוסטה ריקה, להכנת ניתן לדגימה. אנו מודים לה לאטטנקמפ & לוץ וייגרבה לקבלת גישה ואוסף דגימות של אגרופים מהאגף מתוך לטשטש את העטלפים ליצירת תרבות סלולרית. העטלפים מקורם במושבת הרבייה בביולוגיה המחלקה השנייה של אוניברסיטת לודוויג-מקסימיליאן במינכן. אישור לשמור ולקיים את העטלפים הונפק על ידי המשרד הוטרינרית במחוז מינכן. LMD, SJR, KTJD, ו LMD מומן על ידי NSF-דאב 1442142. LMD מומן על ידי NSF-דאב 1838273. LRY מומן על ידי NSF-PRFB 1812035. SCV ו-PD מומן על ידי פרס קבוצת מחקר Max פלאנק, ו תוכנית המדע גבולות האדם (HFSP) מענק מחקר (RGP0058/2016). SJR, JHTP, ו KTJD מומן על ידי מועצת המחקר האירופי (ERC החל מענק 310482 [EVOGENO]) הוענק SJR, ECT מומן על ידי מלגת מועצת המחקר האירופי (ERC-2012-StG311000).
Materials
| 1.5 mL Eppendorf Safelock tubes | Fischer Scientific | 10509691 | 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62,554,002 | 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 2 mL cryovials | Thomas Scientific | 1154P75 | cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen |
| 3-mm biopsy punch | Medline | MIL3332 | wing biopsy punch for cell culture |
| 6 well plate | Greiner | 83,392 | Culture vessle |
| Allprotect Tissue Reagent | Qiagen | 76405 | for fecal samples; tissue stabilizing solution |
| Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber | Bio-Rad | 145-0011 | Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad |
| collagenase IV | Stemcell Technologies | 7909 | For dissociation of primary cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | Prevents crystalization of water during freezing of the cells. |
| DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 12491-015 | culture media |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190169 | Balanced salt solution used for washing cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Fischer Scientific | 10270106 | Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells |
| Gentamycin sulfate salt | Sigma Aldrich | G1264-250MG | Antibiotic for culture media |
| Nalgene Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0050 | Freezing container which provides 1°C/min cooling rate |
| PARAFILM | Sigma | P7793 | Wrapping tubes etc for sealing |
| Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x | Invitrogen | 15140130 | Antibiotic for culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water |
| RNAlater | Thermo Fisher | AM7021 | RNA stabilizing solution |
| RNAse away | Genetech | 83931-250mL | breaks down enzymes that lead to RNA degradation |
| Silica gel | Fisher Scientific | 7631-86-9 | dessicant agent |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Automated cell counter |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | Cell stain used to assess cell viability |
| trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 | For dissociation of cells during splitting |
Riferimenti
- Jiao, W. B., Schneeberger, K. The impact of third generation genomic technologies on plant genome assembly. Current Opinion in Plant Biology. 36, 64-70 (2017).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Naquin, D., Thermes, C. The third revolution in sequencing technology. Trends in Genetics. 34 (9), 666-681 (2018).
- Lee, H., et al. Third-generation sequencing and the future of genomics. bioRxiv. , 048603 (2016).
- Mayjonade, B., et al. Extraction of high-molecular-weight genomic DNA for long-read sequencing of single molecules. BioTechniques. 62 (1), xv (2017).
- Teeling, E., et al. Bat biology, genomes, and the Bat1K project: To generate chromosome-level genomes for all living bat species. Annual Review of Animal Biosciences. 6 (12), 1-24 (2018).
- Jones, G., Teeling, E. C., Rossiter, S. J. From the ultrasonic to the infrared: molecular evolution and the sensory biology of bats. Frontiers in Physiology. 4 (117), 1-16 (2013).
- Vincenot, C. E., Florens, F. B. V., Kingston, T. Can we protect island flying foxes. Science. 355 (6332), 1368-1370 (2017).
- Blehert, D. S., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen?. Science. 323 (5911), 227 (2009).
- Foley, J., Clifford, D., Castle, K., Cryan, P., Ostfeld, R. S. Investigating and managing the rapid emergence of White Nose Syndrome, a novel, fatal, infectious disease of hibernating bats. Conservation Biology. 25 (2), 223-231 (2011).
- Foley, N. M., et al. Growing old, yet staying young: The role of telomeres in bats’ exceptional longevity. Science Advances. 4, (2018).
- Dammann, P. Slow aging in mammals—Lessons from African mole-rats and bats. Seminars in Cell and Developmental Biology. 70, 154-163 (2017).
- Tsagkogeorga, G., Parker, J., Stupka, E., Cotton, J. A., Rossiter, S. J. Phylogenomic analyses elucidate the evolutionary relationships of bats. Current Biology. 23 (22), 2262-2267 (2013).
- Rohland, N., Reich, D. C. o. s. t. -. e. f. f. e. c. t. i. v. e. high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Yohe, L. R., et al. Trpc2 pseudogenization dynamics in bats reveal ancestral vomeronasal signaling, then pervasive loss. Evolution. 71 (4), 923-935 (2017).
- Shen, B., Han, X., Zhang, J., Rossiter, S. J., Zhang, S. Adaptive evolution in the glucose transporter 4 gene Slc2a4 in Old World fruit bats (family: Pteropodidae). PLoS ONE. 7 (4), e33197 (2012).
- Rojas, D., Warsi, O. M., Dávalos, L. M. Bats (Chiroptera: Noctilionoidea) challenge a recent origin of extant neotropical diversity. Systematic Biology. 65 (3), 432-448 (2016).
- Vonhof, M. J., Russell, A. L. Genetic approaches to the conservation of migratory bats: a study of the eastern red bat (Lasiurus borealis). PeerJ. 3, e983 (2015).
- Korstian, J. M., Schildt, A. J., Bennett, V. J., Williams, D. A., Hale, A. M. A method for PCR-based identification of bat species from fecal samples. Conservation Genetics Resources. 7 (4), 803-806 (2015).
- Bailey, S. E., et al. The use of museum samples for large-scale sequence capture: A study of congeneric horseshoe bats (family Rhinolophidae). Biological Journal of the Linnean Society. 117 (1), 58-70 (2016).
- Boston, E. S. M., et al. Empirical assessment of non-invasive population genetics in bats: Comparison of DNA quality from faecal and tissue samples. Acta Chiropterologica. 14 (1), 45-52 (2012).
- Puechmaille, S. J., Mathy, G., Petit, E. J. Good DNA from bat droppings. Acta Chiropterologica. 9 (1), 237-249 (2007).
- Corthals, A., et al. From the field to the lab: Best practices for field preservation of bat specimens for molecular analyses. PLoS ONE. 10 (3), 1-12 (2015).
- Kacprzyk, J., Teeling, E. C., Kelleher, C., Volleth, M. Wing membrane biopsies for bat cytogenetics: Finding of 2n = 54 in Irish Rhinolophus hipposideros (Rhinolophidae, Chiroptera, Mammalia) supports two geographically separated chromosomal variants in Europe. Cytogenetic and Genome Research. 148 (4), 279-283 (2016).
- Greville, L. J., Ceballos-Vasquez, A., Valdizón-Rodríguez, R., Caldwell, J. R., Faure, P. A. Wound healing in wing membranes of the Egyptian fruit bat (Rousettus aegyptiacus) and big brown bat (Eptesicus fuscus). Journal of Mammalogy. 99 (4), 974-982 (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 403-414 (2018).
- Shaw, T. I., et al. Transcriptome sequencing and annotation for the Jamaican fruit bat (Artibeus jamaicensis). PLoS one. 7 (11), e48472 (2012).
- Seim, I., et al. Genome analysis reveals insights into physiology and longevity of the Brandt’s bat Myotis brandtii. Nature communications. 4, 2212 (2013).
- Lei, M., Dong, D., Mu, S., Pan, Y. H., Zhang, S. Comparison of brain transcriptome of the greater horseshoe bats (Rhinolophus ferrumequinum) in active and torpid episodes. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Lee, A. K., et al. De novo transcriptome reconstruction and annotation of the Egyptian rousette bat. BMC Genomics. 16 (1), 1-11 (2015).
- Francischetti, I. M. B., et al. The “Vampirome”: Transcriptome and proteome analysis of the principal and accessory submaxillary glands of the vampire bat Desmodus rotundus, a vector of human rabies. Journal of Proteomics. 82, 288-319 (2013).
- Wen, M., et al. Exploring the genome and transcriptome of the cave nectar bat Eonycteris spelaea with PacBio long-read sequencing. GigaScience. (September), 1-8 (2018).
- Gonzalez-Garay, M. L. Introduction to isoform sequencing using pacific biosciences technology (Iso-Seq). Transcriptomics and Gene Regulation. , 141-160 (2016).
- Paulo, J. A., Lee, L. S., Banks, P. A., Steen, H., Conwell, D. L. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded pancreatic tissue using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Pancreas. 41 (2), 175 (2012).
- Wiśniewski, J. R. Proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. (79), (2013).
- Sadier, A., et al. Evidence for multifactorial processes underlying phenotypic variation in bat visual opsins. bioRxiv. , 300301 (2018).
- Sotero-Caio, C. G., et al. Integration of molecular cytogenetics, dated molecular phylogeny, and model-based predictions to understand the extreme chromosome reorganization in the Neotropical genus Tonatia (Chiroptera: Phyllostomidae). BMC Evolutionary Biology. 15 (1), 1-15 (2015).
- Baker, R. J., Hamilton, M. J., Parish, D. A. . Preparations of mammalian karyotypes under field conditions. , (2003).
- Song, H., Buhay, J. E., Whiting, M. F., Crandall, K. A. Many species in one: DNA barcoding overestimates the number of species when nuclear mitochondrial pseudogenes are coamplified. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (36), 13486-13491 (2008).
- Pooniya, S., Lalwani, S., Raina, A., Millo, T., Das Dogra, T. Quality and quantity of extracted deoxyribonucleic Acid (DNA) from preserved soft tissues of putrefied unidentifiable human corpse. Journal of Laboratory Physicians. 6 (1), 31 (2014).
- Camacho-Sanchez, M., Burraco, P., Gomez-Mestre, I., Leonard, J. A. Preservation of RNA and DNA from mammal samples under field conditions. Molecular Ecology Resources. 13, 663-673 (2013).
- Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Current Protocols in Cell Biology. 66 (1), 1 (2015).
- Database, J. S. E. Using a hemacytometer to count cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2018).
- Dávalos, L. M., Velazco, P. M., Warsi, O. M., Smits, P. D., Simmons, N. B. Integrating incomplete fossils by isolating conflicting signal in saturated and non-independent morphological characters. Systematic Biology. 63 (4), 582-600 (2014).
- Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA Integrity Number (RIN)-Standarization of RNA quality control. Nano. , 1-17 (2004).
- Leary, S., et al. . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
- Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post morterm interval. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
- Hecht, A. M., Braun, B. C., Krause, E., Voigt, C. C., Greenwood, A. D., Czirják, G. Plasma proteomic analysis of active and torpid greater mouse-eared bats (Myotis myotis). Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).
- Ball, H. C., Levari-Shariati, S., Cooper, L. N., Aliani, M. Comparative metabolomics of aging in a long-lived bat: Insights into the physiology of extreme longevity. PLoS ONE. 13 (5), 1-20 (2018).
- Kacprzyk, J., et al. A potent anti-inflammatory response in bat macrophages may be linked to extended longevity and viral tolerance. Acta Chiropterologica. 19 (2), 219-228 (2017).
- Littlefair, J. E., Clare, E. L. Barcoding the food chain: from Sanger to high-throughput sequencing. Genome. 59 (11), 946-958 (2016).
- Phillips, C. D., et al. Microbiome analysis among bats describes influences of host phylogeny, life history, physiology and geography. Molecular Ecology. 21 (11), 2617-2627 (2012).
- Carrillo-Araujo, M., et al. Phyllostomid bat microbiome composition is associated to host phylogeny and feeding strategies. Frontiers in Microbiology. 6 (May), 1-9 (2015).
- Hughes, G. M., Leech, J., Puechmaille, S. J., Lopez, J. V., Teeling, E. C. Is there a link between aging and microbiome diversity in exceptional mammalian longevity?. PeerJ. 6, e4174 (2018).
- Pannkuk, E. L., et al. Fatty acid methyl ester profiles of bat wing surface lipids. Lipids. 49 (11), 1143-1150 (2014).
- Pannkuk, E. L., et al. Glycerophospholipid profiles of bats with white-nose syndrome. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (4), 425-432 (2015).
