Tissue innsamling av ball for-omics analyser og primær Cell kultur

Summary

Dette er en protokoll for optimal vev forberedelse for genomisk, transcriptomic, og Proteomikk analyser av ball fanget i naturen. Det inkluderer protokoller for bat fangst og disseksjon, vev bevaring, og celle dyrking av bat vev.

Abstract

Som høy gjennomstrømming sekvensering teknologier forhånd, standardiserte metoder for høy kvalitet vev oppkjøp og bevaring tillate forlengelse av disse metodene til ikke-modell organismer. En rekke protokoller for å optimalisere vev samling fra ball er utviklet for en rekke høy gjennomstrømming sekvensering tilnærminger. Skissert her er protokoller for fangst av ball, ønsket demografi skal samles for hver bat, og optimaliserte metoder for å minimere stress på en bat under vev samling. Spesielt skissert er metoder for innsamling og behandling av vev for å oppnå (i) DNA for høy molekylvekt genomisk analyser, (II) RNA for vevs spesifikke transcriptomes, og (III) proteiner for Proteomikk-analyser. Til slutt, også skissert er en metode for å unngå dødelige prøvetaking ved å skape levedyktig primær cellekulturer fra vingen klipp. En sentral motivasjon av disse metodene er å maksimere mengden av potensielle molekylære og morfologiske data for hver bat og foreslå optimale måter å bevare vev slik at de beholder sin verdi som nye metoder utvikles i fremtiden. Dette standardisering har blitt spesielt viktig som initiativer for å sekvens kromosom nivå, feilfri genomer av arter over hele verden har dukket opp, der flere vitenskapelige partier er spissen sekvensering av ulike taksonomisk Grupper. Protokollene skissert her definerer den ideelle vev innsamling og vev bevaring metoder for Bat1K, konsortiet som er sekvensering av genomer av alle arter av bat.

Introduction

Metoder for høy gjennomstrømming sekvensering (HTS) har raskt Avansert i effektivitet og redusert i kostnader, og det er nå mulig å skalere disse tilnærmingene til hundrevis eller tusenvis av prøvene. Innsikt innhentet av anvendelsen av disse teknologiene har enorme virkninger på tvers av flere vitenskapelige disipliner, fra biomedisin til evolusjon og økologi^1,2,3. Likevel, mange HTS-programmer stole kritisk på høy kvalitet nukleinsyre syrer fra en levende kilde. Denne begrensningen vil trolig bli stadig mer problematisk med utviklingen av tredje generasjons sekvensering basert på lang-Les molekyler⁴. Av disse grunner er det behov for å fokusere arbeidet med å etablere beste praksis for å samle ferske vevsprøver fra ville organismer utenfor laboratoriet, noe som maksimerer nytten av materiale og reduserer antall individer som må Samlet.

Bat1K er et internasjonalt konsortium av forskere med et pågående initiativ for å sekvens de Genova av alle arter av bat til kromosom nivå montering⁵. Ball representerer 20% av pattedyr mangfold og har eksepsjonelle tilpasninger som har implikasjoner for å forstå aldring, sykdoms økologi, sensorisk biologi og metabolisme^5,6. Mange ball er også truet eller truet på grunn av menneskelig utnyttelse⁷ eller er raskt fallende på grunn av patogener^8,9, og Genova-nivå sekvensering er av stor betydning for bevaring av disse artene. Selv om Bat1K tiden har som mål å sekvens genomer av alle bat arter, er standardisering av samling av vevsprøver for høy kvalitet genomisk sekvensering en viktig utfordring over fellesskapet av organismal biologer. I tillegg til å genomisk data, krever funksjonell forståelse av mangfoldet av bat-tilpasninger vevs spesifikke transcriptome-og protein analyser, som ofte krever separate innsamlings protokoller. Videre, som med alle taksonomisk grupper, mens optimal vev innsamling og bevaring er avgjørende for å oppnå den høyeste kvalitetsdata for-omics analyser, kommuniserer beste praksis er ofte vanskelig på grunn av raskt skiftende teknologier og flere forskergrupper som arbeider selvstendig.

Behovet for å vedta beste praksis for bat-omics forskning er spesielt presserende, gitt at mange bat arter er sjeldne eller truet. I motsetning til andre små pattedyr som gnagere og shrews, er ball lang levetid, tilskrives eksepsjonell DNA reparasjon mekanismer¹⁰ og langsom reproduksjon¹¹, med de fleste arter som føder bare én eller (i noen tilfeller) to unge per år. Av disse grunner, kan bat populasjoner være trege til å gjenopprette fra forstyrrelser, og samle mange individer fra naturen er verken tilrådelig eller gjennomførbart. Med andre ord, protokoller må optimaliseres for å få den maksimale mengden data for en enkelt prøve, og dermed redusere behovet for unødvendig replikere prøvetaking innsats.

Her fokuserer denne protokollen spesifikt på standardiserte metoder for innsamling og prøvetaking av bat vev for genomisk og transcriptomic sekvensering og protein analyser. Den øverste prioritet er å sikre at bat vev er samlet etisk og ansvarlig, alt fra tillatelsesprosessen for innsamling, eksport av vev til minimering av stress til dyret, og langsiktige lagringsforhold. Forseggjort dissections har blitt utviklet med sikte på å fremtids-Proofing nytten av ulike materialer samlet. Dette manuskriptet gir en steg-for-steg guide til å samle ball på en human måte som er ment å minimere innvirkning på populasjoner og maksimere vitenskapelig verdi. Mens fokus for denne protokollen er spesielt for bruk i ball, mange av trinnene er relevante for andre virveldyr dyr, spesielt pattedyr.

Oversikt over vevs innkreving
Prosedyren for vev samling, inkludert temperaturen for lagring og valg av bevare agent, vil bli bestemt av arten av eventuelle nedstrøms analyser planlagt. Men, det anbefales sterkt at, når det er mulig, er vev samlet under en rekke metoder for å maksimere sin fremtidige nytte selv om ingen spesifikk analyse er planlagt. Generelt er vev samlet og bevart for senere analyser av enten nukleinsyre syrer (DNA og RNA), eller protein. For hver av disse programmene, kan vevet bli optimalt bevart ved direkte blits frysing i flytende nitrogen (LN2). Men umiddelbar nedsenking i LN2 er ikke alltid mulig i feltet. Etter hvert som teknologien utvikler seg, blir ressurser som spesialiserte hetteglass for å lagre DNA og RNA ved omgivelsestemperaturer lettere tilgjengelige. Selv om vi ikke har validert alle slike materialer i denne protokollen, oppfordrer vi andre forskere til å forholdsvis analysere resultatene av nye materialer i forhold til det vi presenterer her. Vi gir metoder for å ideelt bevare vev for ulike applikasjoner i situasjoner der LN2 ikke kan nås, for eksempel når LN2 transport er ikke mulig på grunn av tilgang til nettstedet via lite fly i Amazonas. I tillegg gir vi en metode for å samle vev som levende celler kan dyrkes og spres. Nedenfor skisserer vi viktige hensyn for innsamling av materiale for hver av disse respektive formål og en oversikt over innsamlings metoder er gitt i tabell 1.

Vev for DNA
For alle høstet vev samlet, vil lagringsmediet avgjøre om det kan brukes til enten standard eller høy molekylvekt (HMW) DNA-ekstraksjon. HMW er nødvendig for lang lese sekvenser og for tiden kreves for å generere kromosom nivå Genova samlinger, eller en “platina standard” Genova. Lav molekylvekt (LMW) DNA kan utvinnes fra Flash frosset, AllProtect (heretter referert til som “vev stabilisere løsning”), eller til og med RNAlater (heretter “RNA stabilisere løsning”)-bevarte prøver (selv om Flash frosne prøvene forbli optimal ). DNA isolert av standard laboratorie metoder (f. eks silica gel membran spin kolonner, fenol-kloroform), kan fortsatt gi DNA-fragmenter på opptil ~ 20 kilobases (KB). Derfor forutsatt at det er tilstrekkelig utbytte, kan denne formen for isolert DNA brukes til enkelt sette størrelse bibliotek forberedelse, der innsatsen størrelsen er ofte ~ 500 base-par (BP), og kort sekvens leser av ~ 100 BP er generert¹². Dette DNA er spesielt nyttig for “resequencing” prosjekter eller studier der full lengde kromosom data er ikke nødvendig. HMW DNA (10-150 kB) er mer utfordrende og kan bare bli pålitelig innhentet ved hjelp av vev som har blitt raskt blinke frosset i LN2 etter innhøsting og opprettholdt på maksimalt-80 ° c til ekstraksjon.

Lav molekylvekt eller fragmentert DNA er ofte tilstrekkelig for målrettede tilnærminger, inkludert gen forsterkning via PCR og kortleser sekvenser¹³. PCR-baserte undersøkelser ved hjelp av LMW DNA som mål bare én eller noen få gener har vært svært informativ i forståelsen tilpasning og molekylær evolusjon av bat sensorisk biologi^6,14, fysiologi¹⁵, phylogenetics ^5,16og bevaring^17,18. Vellykket målrettet sekvens gjenerobre av lav molekylvekt og fragmentert DNA har også blitt demonstrert for mange virveldyr grupper, inkludert ball¹⁹. Disse metodene er ofte kostnadseffektive og minimalt invasiv til bat, som avføringsprøver og ikke-dødelige vev prøvetaking via bukkal pensle eller vinge biopsi slag er også vanlige måter å få DNA for lav molekylvekt analyser^{20, 21}i denne.

Imidlertid avhenger kvaliteten sterkt på hvilken type medier der prøven er lagret²². Etter systematisk og kvantitativ sammenligninger av bukkal servietter og biopsi slag, har vinge biopsi slag vist å gi gjennomgående høyere nivåer av DNA og var mindre stressende til balltre under samlingen²². Disse sammenligningene viste også at de beste resultatene ble oppnådd når vingen punch ble bevart i indikator silika (dvs. en type tørkemiddel laget av silika gel perler som skifter farge når fuktighet er observert) i stedet for i andre populære lagringsmedier som etanol eller DMSO²²; Selv om andre lagringsmedier, inkludert vevs stabiliserings løsning, ikke ble undersøkt. Vinge slag kan også brukes til å dyrke Fibroblast celler i kulturen, slik som i Kacprzyk et al.²³ og som beskrevet nedenfor (se pkt. 6). For disse metodene bør vingen eller uropatagium utvides forsiktig, og en ren biopsi punch, vanligvis 3 mm i diameter, bør brukes til å få prøven. Denne tilnærmingen ser ut til å forårsake ingen varig skade, med arr healing over i løpet av uker i de fleste tilfeller²⁴.

HMW DNA (10-150 kB) er mer utfordrende og er foreløpig bare pålitelig innhentet ved hjelp av vev som har vært raskt blinke frosset i LN2 etter innhøsting og opprettholdt på maksimalt-80 ° c til ekstraksjon. HMW DNA (10-150 kB) er avgjørende for lang-lese DNA sekvensering og derfor for de Novo Genova montering. Faktisk, mens de fleste kommersielle kits kan brukes til å isolere noen standard HMW DNA, den resulterende molekylet størrelser ofte ikke oppfyller kravene i tredje generasjons sekvensering teknologier [f. eks de lansert av selskaper som Pacific biovitenskap (PacBio), Oxford Nanopore Technologies, og 10x Genomics, eller gjennom montering metoder som tilbys av Bionano Genomics eller Svalehale Genomics]. Som sådan, det er en ny etterspørsel etter “Ultra HMW” DNA (> 150 kB). Når oppnå ultra HMW DNA fra ball, friske prøver av leveren, hjernen, eller muskelen er alle egnet, men disse må umiddelbart blinke frosset i LN2 uten lagrings buffer eller kryoprotektant. En fullstendig beskrivelse av disse trinnene er utenfor omfanget av dette papiret, men er tilgjengelig andre steder²⁵.

Vev for RNA
RNA er en enkelt-strandet molekyl som er mindre stabilt enn DNA. Selv om det er mange former for RNA,-omics analyser har en tendens til å fokusere på mRNA (Messenger RNA) og små RNAs (f. eks, microRNAs). Etter transkripsjon, er mRNA skjøtes å danne en moden transkripsjon som inneholder ingen introns og representerer koding del av gener/genomer. Coding gener utgjør en liten brøkdel av Genova størrelse (1%-2%), noe som gjør målretting mRNA en kostnadseffektiv måte å skaffe sekvens data for gener. MicroRNAs er en klasse av RNAs som regulerer prosessen med oversettelse av mRNA til proteiner og er således viktige regulatoriske effekt Orer. RNA-transkripsjoner kan være sekvensielt individuelt, eller mer vanlig for-omics analyser^{26,27,28,29,30}, som en del av en transcriptome; det vil si summen av alle RNA-transkripsjoner som finnes i et gitt utvalg.

Sekvensering kan utføres følgende flere metoder (dvs. via Short-Les RNA-SEQ eller lang-lese hele isoformen SEQ), slik at analyse av både RNA overflod og isoformen bruk. Ettersom mengden og mangfoldet av mRNA transkripsjoner varierer mellom celler og vev, gjør RNA sekvensering det mulig å studere og sammenligne genuttrykk og regulering på tvers av prøvene. Interessen for sekvensering små RNAs og hele isoformen sekvensering vokser, da disse metodene blir stadig mer biologisk informative. Utarbeidelse av vevsprøver for å sekvens forskjellige klasser av RNA kan utføres på samme måte som presentert i dette manuskriptet, med bare de påfølgende utvinnings metodene ulik^31,32. Til slutt, fordi transcriptomes tilbyr en høy dekning undergruppe av protein-koding Genova, det sammensatte datasettet kan være nyttig i Genova montering og merknader, noe som gjør innsamling av RNA-SEQ data på tvers av en rekke ulike vev en viktig del av Bat1K initiativ.

I motsetning til DNA, er RNA kjemisk ustabil og også målrettet av RNase-enzymer, som er overalt til stede i vev lysater som en defensiv strategi mot RNA-baserte virus. Av disse grunner begynner RNA-fraksjonen i celler og vev å brytes ned kort tid etter det punktet av prøvetaking og/eller døds aktiv. Å bevare RNA-en krever derfor trinn for å hindre nedbrytning. Dette innebærer vanligvis å bevare ferskt samlet vev ved 4 ° c i et stabiliserende middel som RNA stabiliserende løsning for å deaktivere RNases naturlig tilstede i vev, etterfulgt av frysing for lengre tids lagring. Som et foretrukket alternativ, kan vevet blinke frosset i LN2; men som nevnt ovenfor, transport LN2 inn i feltet og opprettholde nivåer for å hindre at vevet tine kan være logistisk utfordrende.

Vev for protein
Protein sammensetning og relativ overflod varierer mellom celler og vev på en lignende måte som det som ble diskutert for RNA; men proteiner er i gjennomsnitt mer stabile enn RNA. Protein identifisering bruker Proteomikk vanligvis samsvarer med en brøkdel av, og ikke hele, protein sekvensen, men det kan gi informasjon om uttrykk på tvers av vev og karakterisere patogener stede. Så mange protein sekvenser er bevart på tvers av pattedyr, kan bat prøver for Proteomikk lett bli forurenset med bevarte menneskelige proteiner, krever sterile protokoller (f. eks, hansker, tang) under innsamling. Mens Flash-frysing i LN2 er den beste måten å hindre degradering av proteiner, bruk av tørr is,-20 ° c frysere, og selv isen er egnet hvis det ikke er andre midler. Ettersom temperaturene øker, stiger også risikoen for differensial protein sammenbrudd. Stabiliserende midler som vev stabilisering løsning er effektive i å bevare protein brøkdel av vev ved romtemperatur og er egnet for kortsiktig bevaring (opptil en uke) når Flash-frysing er ikke levedyktig.

Enzymatisk profil av et gitt vev direkte påvirker bevaring av protein deri. Vev med lav enzymatisk aktivitet som muskel kan bevare protein profiler selv ved høyere temperaturer i en husholdning fryser. Til sammenligning er leveren vev enzymatisk reaktive, og dens proteiner har høyere sannsynlighet for nedverdigende under forberedelse. Det økende antallet protokoller for innhenting av menneskelige Proteomikk profiler fra formalin para fin-innebygde (FFPE) prøver tyder på at paraformaldehyde innfesting av vev holder løftet om rimelig protein bevaring når frysing ved oppsamling ikke er gjennomførbart^33,34. Selv om det er svært avhengig av bevaring tid og tilstand, har proteiner blitt identifisert via immunhistokjemi fra formalin-faste, etanol-bevarte bat eksemplarer³⁵. Denne tilnærmingen er ikke skalerbar til Proteomikk-nivå prøvetaking, men fremhever potensialet for formalin-fast bat vev å gi protein profiler når Flash-frysing er utilgjengelig og andre stabiliserende agenter er for kostbare.

Vev for cellekultur
Prøvetaking vev og Flash-frysing tilbyr en begrenset mengde materiale som skal brukes, og når materialet er brukt, er det ikke lenger tilgjengelig. Alternativt, cellen kulturen skaffe bo celler det kan med det samme anvendt eller bevart for fremtid studier. Kulturer også lette utvidelse av celler for å øke utbyttet når vevsprøver er små. Det er spesielt nyttig i tilfeller der vev samling er begrenset, for eksempel eksperimenter med sjeldne arter der ikke-dødelige prøvetaking er viktig og derfor har bred implikasjoner for bevaring. Beskrevet er en protokoll der cellekultur er mulig via ikke-dødelige prøvetaking av vinge membran vev, men dyrking er mulig med flere vevstyper^36,37. Protokollen som er angitt her, velger for tilhenger celler. Kombinasjonen av kilde vev og vekst medier som brukes gjør denne protokollen egnet til å velge og vokse fibroblaster, men hvis ønskelig, kan alternative protokoller brukes til å velge for andre celletyper. I sammenheng med Bat1K prosjektet, er det spådd at for sjeldne og truede arter, ikke-dødelige prøvetaking av vinge membraner og utvidelse av prøvene via dyrking er avgjørende for å generere volumet av DNA som trengs for flere teknologier ansatt⁵ .

Bat-opptak
Alle mennesker håndtering av ball bør trenes av en bat-kompetent forsker og vaksinert mot rabies med en rekke pre-eksponering injeksjoner. Hvis bitt, en ytterligere serie av post-eksponering injeksjoner er fortsatt nødvendig. Standard metoder for å fange opp ball inkluderer tåke garn (figur 1) og harpe feller (figur 2). Mist garn er mest brukt og ideelt for områder med lav til moderat aktivitet, som de krever mest forsiktighet for å minimere bat nød. Små ball er spesielt sårbare og kan dø av stress hvis ikke en tendens til å raskt. Hyppige netto inspeksjoner minimerer bat skader og dødelighet, samt skade på tåke nettet. Denne detaljen er viktig fordi riktig vev samlingen krever vevet å være frisk, og uriktig oppmerksomhet til tåke garn i ball kan føre til unødvendig dødelighet eller tidlig dødelighet før forskeren kan riktig prosess prøver. Fordi flere ball kan hvile i en harpe felle med minimal nød, er denne tilnærmingen ideell for områder med høy bat aktivitet, for eksempel i nærheten av en hule eller store hønsehus. Detaljerte instruksjoner for riktig bat fangst og databehandling for innsamling av morfologiske og demografisk informasjon er tilgjengelig i supplerende metoder.

Protocol

Alle metoder som er beskrevet her har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av Stony Brook University (protokoll #2013-2034). 1. døds aktiv Fukt en bomullsdott med en isoflurane bedøvelse eller en annen tilgjengelig bedøvelse. Plasser bomulls kulen i en resealable, lufttett plastpose. Posen skal være stor nok til å holde en pose i en klut bat bag komfortabelt. Etter flere minutter med å la posen til å trenge gjennom bedøvel…

Representative Results

DnaFor standard lav molekylvekt (LMW) analyser, ble DNA Hentet fra tre Neotropical bat arter. Vevsprøver ble samlet inn i feltet fra den dominikanske republikk og Costa Rica, etter protokollene beskrevet i dette papiret. Etter disseksjon, ble små biter (< 0,5 cm i den tynneste delen) av blandet vev (hjerne, lever og tarm) plassert i RNA stabiliserings løsning, blits frosset, deretter lagret ved-80 ° c. Utdrag ble utført ved hjelp av standard DNA utvinnings protok…

Discussion

Protokollen som omtales i dette manuskriptet beskriver den beste sampling-praksisen for forskjellige molekylære analyser av høy gjennomstrømming av ball. Alle vellykkede-omics studier krever høy kvalitet vev, men prøvetaking bat vev, samt andre ikke-modell organismer, ofte oppstår i feltet forhold som ikke kan settes til samme standarder som de av en kontrollert laboratorium innstilling. Prøvetaking skjer ofte på avsidesliggende steder, med minimale ressurser, inkludert begrenset tilgang til elektrisitet og fryse…

Materials

1.5 mL Eppendorf Safelock tubes	Fischer Scientific	10509691	1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol
15 mL tubes	Sarstedt	62,554,002	15 mL sterile tubes used during cell culture protocol
2 mL cryovials	Thomas Scientific	1154P75	cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen
3-mm biopsy punch	Medline	MIL3332	wing biopsy punch for cell culture
6 well plate	Greiner	83,392	Culture vessle
Allprotect Tissue Reagent	Qiagen	76405	for fecal samples; tissue stabilizing solution
Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber	Bio-Rad	145-0011	Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad
collagenase IV	Stemcell Technologies	7909	For dissociation of primary cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650-5X5ML	Prevents crystalization of water during freezing of the cells.
DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher	12491-015	culture media
Dulbecco's PBS	Invitrogen	14190169	Balanced salt solution used for washing cells
Fetal bovine serum (FBS)	Fischer Scientific	10270106	Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells
Gentamycin sulfate salt	Sigma Aldrich	G1264-250MG	Antibiotic for culture media
Nalgene Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0050	Freezing container which provides 1°C/min cooling rate
PARAFILM	Sigma	P7793	Wrapping tubes etc for sealing
Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x	Invitrogen	15140130	Antibiotic for culture media
Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4	Thermo Fisher	10010023	salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water
RNAlater	Thermo Fisher	AM7021	RNA stabilizing solution
RNAse away	Genetech	83931-250mL	breaks down enzymes that lead to RNA degradation
Silica gel	Fisher Scientific	7631-86-9	dessicant agent
TC20 Automated Cell Counter	Bio-Rad	1450102	Automated cell counter
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013	Cell stain used to assess cell viability
trypsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4049	For dissociation of cells during splitting