Coleção de tecidos de morcegos para análises de Omics e cultura de células primárias
Summary
Este é um protocolo para a preparação óptima do tecido para análises genomic, transcriptomic, e proteômica dos bastões capturados no selvagem. Inclui protocolos para captura e dissecção de morcegos, preservação tecidual e cultivo celular de tecido morcego.
Abstract
Como as tecnologias de sequenciamento de alta produtividade avançam, métodos padronizados para aquisição e preservação de tecidos de alta qualidade permitem a extensão desses métodos a organismos não-modelo. Uma série de protocolos para otimizar a coleta de tecido de morcegos foi desenvolvida para uma série de abordagens de sequenciamento de alta taxa de transferência. Descritos aqui estão os protocolos para a captura de morcegos, a demografia desejada a ser coletado para cada morcego, e métodos otimizados para minimizar o stress em um morcego durante a coleta de tecido. Especificamente delineados são métodos para coletar e tratar o tecido para obter (i) DNA para análises genômicas de alto peso molecular, (II) RNA para transcriptomas específicos do tecido, e (III) proteínas para análises de nível proteômico. Por fim, também esboçado é um método para evitar a amostragem letal através da criação de culturas de células primárias viáveis de clipes de asa. Uma motivação central destes métodos é maximizar a quantidade de dados moleculars e morfológicos potenciais para cada bastão e sugerir maneiras ideais de preservar tecidos assim que mantêm seu valor enquanto os métodos novos se desenvolvem no futuro. Esta padronização tornou-se particularmente importante à medida que surgiram iniciativas para sequenciar genomas de espécies em nível de cromossomo, livres de erros em todo o mundo, nos quais vários partidos científicos estão liderando o sequenciamento de diferentes taxonômicos Grupos. Os protocolos descritos neste documento definem os métodos ideais de coleta e preservação tecidual para Bat1K, o consórcio que está sequenciando os genomas de todas as espécies de morcegos.
Introduction
Os métodos de sequenciamento de alta taxa de transferência (HTS) avançaram rapidamente na eficiência e diminuíram no custo, e agora é possível dimensionar essas abordagens para centenas ou milhares de amostras. Insights obtidos pela aplicação dessas tecnologias têm enormes impactos em várias disciplinas científicas, da biomedicina à evolução e ecologia1,2,3. No entanto, muitas aplicações HTS dependem criticamente de ácidos nucleicos de alta qualidade de uma fonte viva. Essa limitação é susceptível de se tornar cada vez mais problemática com o desenvolvimento de sequenciamento de terceira geração baseado em moléculas de leitura longa4. Por estas razões, há a necessidade de concentrar esforços no estabelecimento de melhores práticas para a coleta de amostras de tecido fresco de organismos selvagens fora do laboratório, o que maximiza a utilidade do material e reduz o número de indivíduos que precisam ser Coletados.
Bat1K é um consórcio internacional de cientistas com uma iniciativa em curso para sequenciar o genoma de todas as espécies de morcegos para a montagem em nível de cromossomo5. Morcegos representam 20% da diversidade de mamíferos e têm adaptações excepcionais que têm implicações para a compreensão do envelhecimento, ecologia de doenças, biologia sensorial e metabolismo5,6. Muitos morcegos também estão ameaçados ou em perigo devido à exploração humana7 ou estão rapidamente em declínio devido a patógenos8,9, esequenciamento de nível de genoma é de grande importância para a conservação destas espécies. Embora o Bat1K atualmente vise sequenciar os genomas de todas as espécies de morcegos, a padronização da coleta de amostras de tecido para sequenciamento genômico de alta qualidade continua sendo um desafio fundamental em toda a comunidade de biólogos organizadores. Além dos dados genóricos, a compreensão funcional da diversidade de adaptações de morcegos requer análises de proteínas e transcriptomas específicas do tecido, muitas vezes exigindo protocolos de coleta separados. Além disso, como em todos os grupos taxonômicos, enquanto a coleta e preservação ideais dos tecidos é essencial para a obtenção de dados de maior qualidade para análises Omics, a comunicação das melhores práticas é muitas vezes difícil por causa de tecnologias em rápida mutação e várias equipes de pesquisa trabalhando de forma independente.
A necessidade de adotar as melhores práticas para a pesquisa bat-ômica é especialmente urgente, uma vez que muitas espécies de morcegos são raras ou ameaçadas. Ao contrário de outros pequenos mamíferos, como roedores e shrews, os morcegos são de longa duração, atribuíveis a mecanismos excepcionais de reparo de DNA10 e reprodução lenta11, com a maioria das espécies dando à luz apenas um ou (em alguns casos) dois jovens por ano. Por estas razões, as populações de morcegos podem ser lentas para se recuperar da perturbação, e a coleta de muitos indivíduos da natureza não é aconselhável nem viável. Em outras palavras, os protocolos devem ser otimizados para obter a quantidade máxima de dados para uma única amostra, reduzindo assim a necessidade de replicar desnecessariamente os esforços de amostragem.
Aqui, este protocolo centra-se especificamente em métodos estandardizados para a coleção e a amostragem do tecido do bastão para o sequenciamento genomic e transcriptômica e as análises da proteína. Sua principal prioridade é garantir que os tecidos de morcego sejam coletados de forma ética e responsável, variando do processo de licenciamento para a coleta, exportação de tecidos para a minimização do estresse para o animal e condições de armazenamento de longo prazo. As dissecções elaboradas foram desenvolvidas com o objetivo de futuro-impermeabilização a utilidade de materiais diferentes recolhidos. Este manuscrito fornece um guia passo-a-passo para coletar morcegos de forma humana que se destina a minimizar o impacto sobre as populações e maximizar o valor científico. Enquanto o foco deste protocolo é especificamente para uso em morcegos, muitas das etapas são relevantes para outros táxons de vertebrados, especialmente mamíferos.
Visão geral da coleção de tecidos
O procedimento para a coleta de tecido, incluindo a temperatura para armazenamento e a escolha do agente de preservação, será determinado pela natureza de quaisquer análises a jusante planejadas. No entanto, é altamente recomendável que, quando possível, o tecido seja coletado uma variedade de métodos para maximizar sua utilidade futura, mesmo que nenhuma análise específica seja planejada. Em geral, o tecido é coletado e preservado para análises subsequentes de ácidos nucleicos (DNA e RNA), ou proteína. Para cada uma dessas aplicações, o tecido pode ser preservado de forma otimizada por congelamento direto do flash em nitrogênio líquido (LN2). No entanto, a imersão imediata em LN2 nem sempre é possível no campo. À medida que a tecnologia avança, recursos como frascos especializados para armazenar DNA e RNA em temperaturas ambientes estão se tornando mais prontamente disponíveis. Embora não tenhamos validado todos esses materiais neste protocolo, incentivamos outros pesquisadores a analisar comparativamente o desempenho de novos materiais em relação ao que apresentamos aqui. Nós fornecemos métodos para preservar idealmente tecido para diferentes aplicações em situações onde LN2 não pode ser acessado, por exemplo, quando o transporte LN2 não é possível devido ao acesso ao site através de um pequeno avião na Amazônia. Além disso, nós fornecemos um método para a coleta de tecido a partir do qual as células ao vivo podem ser cultivadas e propagadas. A seguir, Delineamos as principais considerações para a coleta de material para cada uma dessas finalidades e uma visão geral dos métodos de coleta é dada na tabela 1.
Tecido para DNA
Para todos os tecidos colhidos recolhidos, a mídia de armazenamento determinará se ele pode ser usado para a extração de DNA padrão ou de alto peso molecular (HMW). HMW é exigido para o sequenciamento de leitura longa e atualmente necessário para gerar conjuntos de genoma de nível de cromossomo, ou um “padrão de platina” genoma. O ADN do baixo peso molecular (LMW) pode ser extraído do flash congelado, AllProtect (doravante referido como a “solução estabilizando tecido”), ou mesmo RNAlater (doravante “solução de estabilização do RNA”)-amostras preservadas (embora as amostras congeladas do flash permaneçam óptimas ). DNA isolado por métodos laboratoriais padrão (por exemplo, colunas de rotação de membrana de sílica gel, fenol-clorofórmio), ainda pode produzir fragmentos de DNA de até ~ 20 kilobases (KB). Conseqüentemente, contanto que há um rendimento suficiente, este formulário do ADN isolado pode ser usado para a única preparação da biblioteca do tamanho da inserção, em que o tamanho da inserção é frequentemente ~ 500 pares de base (BP), e as leituras curtas da seqüência de ~ 100 BP são geradas12. Este DNA é particularmente útil para “resequencing” projetos ou estudos em que os dados cromossômicos de comprimento total não é necessária. HMW DNA (10-150 KB) é mais desafiador e só pode ser confiável obtido usando tecido que foi rapidamente flash congelado em LN2 após a colheita e mantido a um máximo de-80 ° c até a extração.
O baixo peso molecular ou o ADN fragmentado são frequentemente suficientes para aproximações alvejadas, incluindo a amplificação do gene através do PCR e o sequenciamento de leitura curta13. As investigações PCR-baseadas que usam o ADN de LMW que visam somente um ou alguns genes foram altamente informativos em compreender a adaptação e a evolução molecular da biologia sensorial6,14do bastão, fisiologia15, phylogenetics 5,16e conservação17,18. A recaptura de seqüência direcionada bem-sucedida de baixo peso molecular e DNA fragmentado também foi demonstrada para numerosos grupos de vertebrados, incluindo morcegos19. Estes métodos são muitas vezes rentáveis e minimamente invasivos para o morcego, como amostras fecais e amostragem de tecido não letal através de cotonetes bucais ou socos de biópsia de asa também são formas comuns de obter DNA para análises de baixo peso molecular20, a 21.
No entanto, a qualidade depende muito do tipo de mídia em que a amostra é armazenada22. Após comparações sistemáticas e quantitativas de cotonetes bucais e punção de biópsia, foram mostrados socos de biópsia de asa para produzir níveis consistentemente mais elevados de DNA e foram menos estressores para o bastão durante a coleta22. Essas comparações também mostraram que os melhores resultados foram obtidos quando o perfurador de asa foi preservado em sílica indicadora (ou seja, um tipo de dessecante feito de grânulos de sílica gel que muda de cor quando a umidade é observada) em vez de outros meios de armazenamento populares, como etanol ou DMSO22; embora, outros meios de armazenamento que incluem a solução da estabilização do tecido não foram examinados. Os socos de asa também podem ser usados para cultivar células fibroblásticas na cultura, como em Kacprzyk et al.23 e conforme descrito abaixo (ver seção 6). Para estes métodos, a asa ou o uropatágio devem ser estendidos delicadamente, e um perfurador limpo da biópsia, tipicamente 3 milímetros no diâmetro, deve ser usado para obter a amostra. Esta aproximação parece causar nenhum dano duradouro, com cicatrizes que curam-se sobre dentro das semanas em a maioria de casos24.
HMW DNA (10-150 KB) é mais desafiador e é atualmente apenas confiável obtido usando tecido que foi rapidamente flash congelado em LN2 após a colheita e mantido a um máximo de-80 ° c até a extração. O DNA de HMW (10-150 KB) é crucial para o sequenciamento de DNA de longa leitura e, portanto, para o conjunto do genoma de de novo. Na verdade, enquanto a maioria dos kits comerciais podem ser usados para isolar algum DNA HMW padrão, os tamanhos das moléculas resultantes muitas vezes não atendem aos requisitos de tecnologias de sequenciamento de terceira geração [por exemplo, aqueles lançados por empresas como a Pacific Biosciences (PacBio), Oxford Nanopore Technologies, e 10x Genomics, ou através de métodos de montagem oferecidos pela Bionano Genomics ou Dovetail Genomics]. Como tal, há uma nova demanda por “ultra HMW” DNA (> 150 KB). Ao obter DNA ultra HMW de morcegos, amostras frescas de fígado, cérebro, ou músculo são todos adequados, mas estes devem ser imediatamente flash congelado em LN2 sem qualquer buffer de armazenamento ou crioprotectant. Uma descrição completa dessas etapas está além do escopo deste documento, mas estão disponíveis em outros lugares25.
Tecido para RNA
O RNA é uma molécula única-encalhado que seja menos estável do que o ADN. Embora existam muitas formas de RNA, análises Omics tendem a se concentrar em mRNA (RNA mensageiro) e RNAs pequenas (por exemplo, microRNAs). Após a transcrição, o mRNA é emenado para formar uma transcrição madura que não contém íntrons e representa a porção de codificação de genes/genomas. Os genes codificantes respondem por uma fração minúscula do tamanho do genoma (1%-2%), tornando o mRNA alvo um meio rentável de obter dados de sequência para genes. MicroRNAs são uma classe de RNAs que regulam o processo de tradução de mRNA em proteínas e são, portanto, importantes efetoras regulatórias. As transcrições de RNA podem ser seqüenciadas individualmente, ou mais comumente para análises de-ômeros26,27,28,29,30, como parte de um transcriptome; ou seja, o total de todas as transcrições de RNA presentes em uma determinada amostra.
O seqüenciamento pode ser realizado seguindo vários métodos (ou seja, via RNA-Seq de leitura curta ou isoforma inteira de leitura longa Seq), permitindo a análise da abundância de RNA e do uso de isoforma. Como a quantidade e a diversidade de transcritos de mRNA variam entre células e tecidos, o sequenciamento de RNA possibilita estudar e comparar a expressão gênica e a regulação em amostras. O interesse em arranjar em seqüência RNAs pequenas e em arranjar em seqüência inteiro do isoforma está crescendo, porque estes métodos estão tornando-se cada vez mais biologicamente informativo. A preparação de amostras de tecido para sequenciar diferentes classes de RNA pode ser realizada da mesma forma apresentada neste manuscrito, com apenas os métodos de extração subsequentes diferindo31,32. Finalmente, porque os transcriptoma oferecem um subconjunto elevado da cobertura do genoma da proteína-codificação, o conjunto de dados montado pode ser útil na montagem e na anotação do genoma, fazendo a coleção de dados do RNA-Seq através de uma escala de tecidos diferentes um componente importante do Iniciativa Bat1K.
Em contraste com o DNA, o RNA é quimicamente instável e também direcionado por enzimas RNase, que são onipresentes em lisados teciduais como uma estratégia defensiva contra vírus baseados em RNA. Por estas razões, a fração de RNA nas células e tecidos começa a degradar logo após o ponto de amostragem e/ou eutanásia. Preservar o RNA exige conseqüentemente etapas para impedir sua degradação. Isto envolve tipicamente preservar o tecido recentemente coletado em 4 ° c em um agente de estabilização tal como a solução de estabilização do RNA para inativar os RNAses naturalmente atuais nos tecidos, seguidos congelando-se para o armazenamento a longo prazo. Como uma alternativa preferida, o tecido pode ser flash congelado em LN2; embora como observado acima, transportando LN2 no campo e mantendo níveis para impedir que o descongelamento do tecido possa ser logisticamente desafiante.
Tecido para proteínas
A composição protéica e a abundância relativa variam entre as células e os tecidos de forma semelhante ao que foi discutido para o RNA; no entanto, as proteínas são, em média, mais estáveis do que o RNA. A identificação proteica usando proteômica normalmente corresponde a uma fração de, e não a seqüência de proteínas inteiras, mas pode fornecer informações sobre a expressão entre os tecidos e caracterizar os patógenos presentes. Como muitas sequências proteicas são conservadas em mamíferos, as amostras de morcegos para proteômica podem ser facilmente contaminadas com proteínas humanas conservados, exigindo protocolos estéreis (por exemplo, luvas, fórceps) durante a coleta. Enquanto o flash-congelamento em LN2 é a melhor maneira de evitar a degradação de proteínas, o uso de gelo seco,-20 freezers ° c, e até mesmo o gelo são adequados se não houver outros meios. Enquanto as temperaturas aumentam, o risco de avaria diferencial da proteína igualmente levanta-se. Agentes estabilizadores como a solução de estabilização tecidual são eficazes na preservação da fração protéica dos tecidos à temperatura ambiente e são adequados para a preservação a curto prazo (até uma semana) quando o flash-congelamento não é viável.
O perfil enzimático de um determinado tecido influencia diretamente na preservação da proteína nele contida. Os tecidos com baixa atividade enzimática, como o músculo, podem preservar os perfis proteicos mesmo nas temperaturas mais elevadas em um freezer doméstico. Por outro lado, o tecido hepático é enzimaticamente reactivo, e as suas proteínas têm probabilidades mais elevadas de degradação durante a preparação. O número crescente de protocolos para a obtenção de perfis proteônicos humanos a partir de formalina-fixo parafina-incorporado (FFPE) amostras sugere que a fixação paraformaldeído de tecidos tem a promessa de baixo custo de preservação da proteína quando o congelamento em cima da coleta não é viável33,34. Embora altamente dependente do tempo e da circunstância da preservação, as proteínas foram identificadas através de Immunohistochemistry dos espécimes formalin-fixados, etanol-preservados do bastão35. Esta aproximação não é evolutiva à amostragem do Proteomic-nível mas realça o potencial para que os tecidos do bastão formalin-fixos produzam perfis da proteína quando o flash-congelamento está indisponível e outros agentes de estabilização são demasiado caros.
Tecido para cultura celular
Tecido de amostragem e flash-congelamento oferece uma quantidade finita de material a ser usado, e uma vez que o material é usado, ele não está mais disponível. Alternativamente, as culturas de células fornecem células ao vivo que podem ser imediatamente usadas ou preservadas para estudos futuros. As culturas também facilitam a expansão das células para aumentar o rendimento quando as amostras de tecido são pequenas. É particularmente útil nos casos em que a coleta de tecido é limitada, como experimentos com espécies raras em que a amostragem não letal é essencial e, portanto, tem amplas implicações para a conservação. É descrito um protocolo em que a cultura da pilha é possível através da amostragem não-letal do tecido da membrana da asa, mas cultivando é possível com os tipos múltiplos do tecido36,37. O protocolo fornecido aqui seleciona para células aderentes. A combinação de tecido de origem e meios de crescimento utilizados torna este protocolo adequado para selecionar e crescer fibroblastos, mas se desejar, protocolos alternativos podem ser usados para selecionar para outros tipos de células. No contexto do projeto Bat1K, prevê-se que para espécies raras e ameaçadas, a amostragem não letal de membranas de asa e expansão de amostras através da cultura é essencial para gerar o volume de DNA necessário para as múltiplas tecnologias empregadas5 .
Captura de morcego
Todas as pessoas que manuseam morcegos devem ser treinadas por um pesquisador competente de morcego e vacinados contra a raiva com uma série de injeções de pré-exposição. Se mordido, uma série mais adicional de injeções da borne-exposição é ainda necessária. Os métodos padrão para capturar morcegos incluem redes de névoa (Figura 1) e armadilhas de harpa (Figura 2). As redes de névoa são mais comumente usadas e ideais para áreas com atividade de baixa a moderada, pois exigem a maioria dos cuidados para minimizar a angústia dos morcegos. Pequenos morcegos são particularmente vulneráveis e podem morrer de stress se não tendem a rapidamente. Inspeções líquidas freqüentes minimizam lesões de morcegos e mortalidade, bem como danos à rede de névoa. Este detalhe é importante porque a coleção apropriada do tecido exige o tecido de ser fresco, e a atenção imprópria às redes da névoa nos bastões pode conduzir à mortalidade desnecessária ou à mortalidade prematura antes que o investigador possa corretamente processar amostras. Porque vários morcegos podem descansar em uma armadilha de harpa com o mínimo de angústia, esta abordagem é ideal para áreas com alta atividade de morcego, como perto de uma caverna ou grande poleiro. As instruções detalhadas para a captação apropriada do bastão e o processamento de dados para a coleção da informação morfológica e demográfica estão disponíveis nos métodos suplementares.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo discutido neste manuscrito descreve as melhores práticas de amostragem para várias análises moleculares de alta produtividade de morcegos. Todos os estudos de sucesso-Omics exigem tecido de alta qualidade, mas o tecido de morcego de amostragem, bem como outros organismos não-modelo, muitas vezes ocorre em condições de campo que não podem ser definidas para os mesmos padrões que os de um ambiente de laboratório controlado. A amostragem ocorre frequentemente em locais remotos, com recursos mínimos, in…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao centro de Ecología y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sánchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vásquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruíz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo, e Fanny Fernández Melo para a confecção de tecidos coleção no Peru possível. Agradecemos também a todos os membros do grupo Jaragua e Yolanda León para fazer coleção de tecidos na República Dominicana possível, bem como para Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita, e todos na estação de pesquisa biológica la selva, na Costa Rica, para fazer amostragem possível. Agradecemos a Ella Lattenkamp & Lutz Wiegrebe para acesso e coleta de amostras de socos de asa de Phyllostomus descolorir morcegos para geração de cultura de células. Phyllostomus descolorir morcegos originados de uma colônia de reprodução no departamento de biologia II da Ludwig-Maximilians-Universidade de Munique. A aprovação para manter e produzir os morcegos foi emitida pelo escritório veterinário do distrito de Munique. LMD, SJR, KTJD e LRY foram financiados pela NSF-DEB 1442142. LMD foi financiado por NSF-DEB 1838273. LRY foi financiado pelo NSF-PRFB 1812035. SCV e PD foram financiados por um prêmio do grupo de pesquisa Max Planck, e um programa de pesquisa de fronteiras humanas (HFSP) Research Grant (RGP0058/2016). SJR, JHTP, e KTJD foram financiados pelo Conselho Europeu de investigação (ERC começando Grant 310482 [EVOGENO]) concedido a SJR, ECT foi financiado pelo Conselho Europeu de investigação Grant (ERC-2012-StG311000).
Materials
| 1.5 mL Eppendorf Safelock tubes | Fischer Scientific | 10509691 | 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62,554,002 | 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 2 mL cryovials | Thomas Scientific | 1154P75 | cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen |
| 3-mm biopsy punch | Medline | MIL3332 | wing biopsy punch for cell culture |
| 6 well plate | Greiner | 83,392 | Culture vessle |
| Allprotect Tissue Reagent | Qiagen | 76405 | for fecal samples; tissue stabilizing solution |
| Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber | Bio-Rad | 145-0011 | Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad |
| collagenase IV | Stemcell Technologies | 7909 | For dissociation of primary cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | Prevents crystalization of water during freezing of the cells. |
| DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 12491-015 | culture media |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190169 | Balanced salt solution used for washing cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Fischer Scientific | 10270106 | Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells |
| Gentamycin sulfate salt | Sigma Aldrich | G1264-250MG | Antibiotic for culture media |
| Nalgene Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0050 | Freezing container which provides 1°C/min cooling rate |
| PARAFILM | Sigma | P7793 | Wrapping tubes etc for sealing |
| Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x | Invitrogen | 15140130 | Antibiotic for culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water |
| RNAlater | Thermo Fisher | AM7021 | RNA stabilizing solution |
| RNAse away | Genetech | 83931-250mL | breaks down enzymes that lead to RNA degradation |
| Silica gel | Fisher Scientific | 7631-86-9 | dessicant agent |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Automated cell counter |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | Cell stain used to assess cell viability |
| trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 | For dissociation of cells during splitting |
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