비교 약물 평가를 위한 호스트로 Zebrafish 애벌레를 사용하여 췌장암의 환자 유래 이종 이종이식 모형
Summary
이 프로토콜은 애벌레 얼룩말어를 숙주로서 사용하여 바이러스 기반 이중 형광 표지 종양 이종이식 모델에서 최적화 절차를 설명합니다. 이 이기종 이종이식 모델은 생체 내 췌장암 미세환경의 조직 조성을 모방하고 맞춤형 zPDX(제브라피쉬 환자 유래 이종이식) 모델에서 약물 반응을 평가하기 위한 보다 정밀한 도구역할을 한다.
Abstract
환자 유래 종양 이종이식(PDX) 및 세포 유래 종양 이종이식(CDX)은 전임상 평가, 약물 지도 및 기초 암 연구를 위한 중요한 기술입니다. 전통적인 호스트 마우스에 있는 PDX 모형의 세대는 시간 소모적이고 견본의 작은 비율을 위해서만 작동합니다. 최근에는 제브라피쉬 PDX(zPDX)가 소규모 및 고효율의 특성을 가진 독특한 숙주 시스템으로 부상하고 있다. 여기서, 우리는 zPDX 모델에서 비교 화학요법 평가를 위한 이중 형광 표지종양 이종이식 모델을 생성하기 위한 최적화된 방법론을 기술한다. 종양 세포 및 섬유아세포는 상이한 배양 조건에서 갓 수확되거나 냉동된 췌장암 조직으로부터 농축되었다. 두 세포 군 모두 녹색 또는 적색 형광 단백질을 발현하는 렌티바이러스뿐만 아니라 항세포자멸 유전자 BCL2L1에의해 표지되었다. 형질감염된 세포를 미리 혼합하고 32°C에서 변형된 E3 배지에서 사육한 2dpf 애벌레 제브라피시내로 공동 주입하였다. 이종이식 모델은 화학요법 약물 및/또는 BCL2L1 억제제에 의해 처리되었고, 종양 세포와 섬유아세포의 부동체를 동시에 조사하였다. 요약하면, 이 프로토콜은 연구원이 이기종 종양 미세 환경을 가진 다량의 zPDX 모델을 신속하게 생성할 수 있게 하고 약물 후보의 효율성을 평가하는 데 있어 더 긴 관찰 창과 보다 정확한 정량을 제공한다.
Introduction
정밀 종양학은 개별 적인 환자를 위한 가장유익한 치료 전략을 찾아내기 위하여 목표 1. 현재, 시험관내 1차 배양, 체외 오르가노이드배양 2, 및 환자 유래 이종이식(PDX)과 같은 수많은 전임상 모델이 유기체 배양 전후의 마우스에서 진단 및 스크리컬/평가전형에 대해 제안되고 있다. 치료 선택3. 면역성 면역성 마우스로 인간 원발성 암세포를 주사하여 생성된 PDX 모델은 임상 종양학에서 맞춤 약물 스크리닝을 위한 가장 유망한 도구 중 하나이며,4. 시험관내 배양된 세포주와는 달리, PDX 모델은 일반적으로 생체 내 종양 환경의 무결성과 이질성을 보존하고, 상이한 종양 환자의 다양성 및 특이성 특성을 더 잘 모방하고, 따라서, 환자의 잠재적 인 의료 결과4. 그러나, 마우스에 있는 PDX 모형의 생성은 다중 단 실험을 위한 충분한 세포 그리고 모형을 집합하기 위하여 고품질 참을성 있는 견본 및 달의 달을 요구하고, 이종이식의 세포/유전 조성은 본래의 그것에서 표류할 수 있습니다 환자의생검. 마우스 PDX 모형을 설치하기위한 성공률은 또한 낮습니다, 임상 사례에서 광범위하게 실행되기 어렵게 만들기. 췌장암 같이 급속하게 진행된 암을 운반하는 환자를 위해, 그(것)들은 PDX 실험에서 시간에 귀중한 정보를 장악하지 못할 수 있습니다.
지난 몇 년 동안, 제브라피쉬는 CDX(세포 유래 종양 이종이식) 모델뿐만 아니라 PDX 모델5,6,7,8,9, 10. 척추 동물로, 제브라피쉬는 유전학과 생리학 모두에서 포유류와 충분한 유사성을 항구, 두 가지 중요한 장점 : 투명성과 크기11작은. Zebrafish는 또한 매우 fecundity, 그리고 근친 유충의 수백 성인의 한 쌍에서 몇 일 이내에 얻을 수 있습니다12. 여러 연구는 암 질환의 형질 전환 및 이종이식 모델을 모두 생성하기 위해 제브라피시를 고용했다13,14. 마우스 이종이식에 비해, 제브라피시 이종이식은 단일 세포 해상도에서 추적을 허용합니다. 일정량의 인간 조직은 수백 개의 제브라피시 PDX 모델(zPDXs)을 생성할 수 있는 반면, 단지 몇 마리의 마우스 PDX모델(15,16)을생성하기에 충분할 수 있다. 게다가, 2-5 dpf에 있는 제브라피시 유충은 이미 간 및 신장과 같은 완전한 순환계 및 신진 대사 기관을 개발하고, 그러나 면역 계통 17은, 나머지 노른자 낭은 자연적인 3D 매체인 동안, 약물 검열, 약 에 이상적 저항성 검사 및종양 이동 관찰 6,18,19,20,21.
임상 사용을 위한 검열/시험 플랫폼으로 zPDX를 사용하는 궁극적인 시도로, 여기에서, 우리는 더 적은 비용으로 더 적은 세포를 사용하여 짧은 시간 안에 생체 내 후보 약물 평가를 허용하는 췌장암의 zPDX 모형을 위한 최적화된 제안을 기술합니다. zPDX 6,9,10에대한 이전 참조와 비교하여, 우리는 임상 개인화 진단을위한 시스템을 보다 실현 가능하고 신뢰할 수 있도록 몇 가지 최적화를 도입했습니다 : 1) 다른 세포를 미리 분류 1 차적인 종양 조직에 있는 단 및 추가 실험의 앞에 1 주일 세포를 위한 안정화; 2) 인간 세포를 표지하고 렌티바이러스 기반 의 유전자 변형을 통해 이종이식에서 세포 생존능력을 향상시키는 단계; 3) 영양 보충제 (포도당 및 글루타민) 및 온도 모두에서 제브라피시 배양 상태를 최적화; 4) 비교 방식으로 상이한 세포 유형의 약물 반응을 정량화한다. 우리는 또한 몇 가지 보충 재료를 추가하여 사출 용액을 변경했습니다. 전부, 그 개선은 후보 약물의 반응을 평가하기 위하여 믿을 수 있는 공구로 이용될 수 있는 zebrafish 호스트에 있는 더 참을성 있는 이종이식을 빨리 생성하는 가능성을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
PDX 및 CDX 모델 모두 종양생물학(22)분야에서 중요한 플랫폼이며, 성공적인 종 간 이식의 중요한 단계는 이종이식의 생존을 개선하는 것이다. 최근, 일부 연구는 BCL2L1 (BCL-XL) 또는 BCL2의 과도 발현이 세포 정체성과 운명에 영향을 미치지 않고 마우스 숙주에서 인간 배아 줄기 세포의 생존력을 크게 향상시킬 수 있음을 보여주었다23 , <…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 81402582, 상하이 12DZ2295100, 14YF1400600 및 18ZR1404500의 자연 과학 재단에 의해 지원되었습니다.
Materials
| DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
| FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
| Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
| Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
| penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
| phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
| HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
| collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
| hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
| DnaseⅠ | Sigma | D5025 | |
| insulin | Sigma | I9278 | |
| b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
| EGF | GIBCO | PHG0314 | |
| pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
| 0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
| concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
| polybrene | Sigma | H9268 | |
| Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
| L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
| gemcitabine | Gemzan | ||
| methylcellulose | Sigma | M0262 | |
| Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
| Equipment | |||
| Microinjector | NARISHIGE | ||
| stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |
Riferimenti
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