परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी स्तनधारी कोशिकाओं में Intracellular जस्ता पूल को मापने के लिए
Summary
सुसंस्कृत प्राथमिक या स्थापित कोशिका रेखाएँ सामान्यतः पशु मॉडलों का उपयोग करने से पहले एक प्रारंभिक दृष्टिकोण के रूप में मौलिक जैविक और यंत्रवादी प्रश्नों को संबोधित करने के लिए उपयोग की जाती हैं । इस प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि कैसे पूरे सेल निष्कर्षों और जस्ता (Zn) और परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ अन्य ट्रेस तत्वों के अध्ययन के लिए subcellular भागों तैयार करने के लिए ।
Abstract
संक्रमण धातुएँ जीवों के लिए आवश्यक सूक्ष्मपोषक होती हैं, लेकिन प्रोटीन में शारीरिक धातुओं के साथ प्रतिस्पर्धा और रेडॉक्स तनाव उत्पन्न करके उच्च सांद्रता में कोशिकाओं के लिए विषाक्त हो सकती हैं । रोग की स्थिति है कि धातु की कमी या संचय के लिए नेतृत्व अलग मानव रोगों के कारण एजेंट हैं । कुछ उदाहरणों में एनीमिया, एक्रोडर्मेटाइटिस एन्टोपथानिका, और विल्सन और मेंक्स के रोग शामिल हैं । इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि उच्च संवेदनशीलता और सटीकता के साथ जैविक नमूनों में संक्रमण धातुओं के स्तर और परिवहन को मापने में सक्षम होना चाहिए ताकि अनुसंधान को सुविधाजनक बनाया जा सके कि कैसे ये तत्व सामान्य शारीरिक कार्यों में योगदान करते हैं और विषाक्तता. जस्ता (Zn), उदाहरण के लिए, कई स्तनधारी प्रोटीन में एक cofactor है, संकेत घटनाओं में भाग लेता है, और कोशिकाओं में एक द्वितीयक दूत है । अतिरिक्त में, Zn विषाक्त है और अंय धातुओं के अवशोषण को बाधित कर सकते हैं, जबकि घाटे में, यह संभावित घातक परिस्थितियों की एक किस्म के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
ग्रेफाइट फर्नेस परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी (GF-आस) विभिंन जैविक नमूनों में Zn और अंय संक्रमण धातु सांद्रता का निर्धारण करने के लिए एक अत्यंत संवेदनशील और प्रभावी तरीका प्रदान करता है । GF के माध्यम से इलेक्ट्रोथर्मल कणिकायन-आस, ब्याज के तत्व के उत्तेजन की तरंगदैर्घ्य का उपयोग करते हुए परवर्ती चयनात्मक अवशोषण विश्लेषण के लिए नमूनों की छोटी मात्रा के परमाणुकरण द्वारा धातुओं की गणना करती है । बीयर-लैम्बर्ट नियम की रैखिकता की सीमा के भीतर, धातु द्वारा प्रकाश का अवशोषण, विश्लेषण के सांद्रण के समानुपाती होता है । Zn सामग्री का निर्धारण करने के अंय तरीकों की तुलना में, GF-आस दोनों स्वतंत्र और complexed Zn प्रोटीन में और संभवतः छोटे नमूनों की मात्रा में उच्च संवेदनशीलता के साथ छोटे intracellular अणुओं में पता लगाता है । इसके अलावा, GF-आस भी प्रेरणिकत: युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईसीपी-एमएस) या synchrotron आधारित एक्स-रे प्रतिदीप्ति से अधिक आसानी से सुलभ है. इस विधि में, एक GF-आस में विश्लेषण के लिए विभिंन संवर्धित सेल लाइनों के व्यवस्थित नमूना तैयार करने का वर्णन किया गया है । इस ट्रेस तत्व में भिंनता की तुलना सिद्धांत के प्रमाण के रूप में पूरे सेल lysates और proliferating और विभेदित कोशिकाओं के subcellular भागों में की गई थी ।
Introduction
संक्रमण और भारी धातुओं, जैसे Zn, Cu, Mn, और Fe, प्राकृतिक रूप से भोजन और प्रदूषकों में दोनों पोषक तत्वों में वातावरण में पाए जाते हैं । सभी जीवों को इन सूक्ष्म पोषक तत्वों की भिन्न मात्रा की आवश्यकता होती है । तथापि, जीवों के लिए उच्च स्तर का जोखिम हानिकारक है । धातु अधिग्रहण आहार के माध्यम से मुख्य रूप से है, लेकिन धातुओं भी सांस या त्वचा के माध्यम से अवशोषित किया जा सकता है1,2,3,4,5। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि वायुमंडलीय कणों में धातुओं की उपस्थिति बढ़ रही है और स्वास्थ्य जोखिमों से काफी हद तक जुड़ी हुई है । मानवजनित कार्यकलापों के कारण, वायुमंडलीय विविक्त पदार्थ, वर्षा जल और मृदा6,7में भारी धातुओं जैसे कि ग, जैसे, सीडी, सीआर, एचजी, एनआई, एफई और पीबी के बढे़ हुए स्तरों का पता चला है । इन धातुओं के लिए आवश्यक शारीरिक ट्रेस तत्वों, विशेष रूप से Zn और Fe के साथ प्रतिस्पर्धा करने की क्षमता है, और वे जैविक प्रक्रियाओं के लिए मौलिक एंजाइमों निष्क्रिय द्वारा विषाक्त प्रभाव प्रेरित ।
ट्रेस तत्व zn रेडॉक्स तटस्थ है और जैविक प्रतिक्रियाओं, जो यह एक मौलिक cofactor में प्रोटीन तह और उत्प्रेरक गतिविधि के लिए आवश्यक बनाता है में एक लुईस एसिड के रूप में बर्ताव करता है 10% से अधिक स्तनधारी प्रोटीन8,9, 10; नतीजतन, यह विविध शारीरिक कार्यों8,11के लिए आवश्यक है । हालांकि, कई तत्वों का पता लगाने की तरह, वहां सामांय शारीरिक समारोह की सुविधा और विषाक्तता के कारण इन धातुओं के बीच एक नाजुक संतुलन है । स्तनधारियों में, zn कमियों एनीमिया के लिए नेतृत्व, विकास मंदता, hypogonadism, त्वचा असामान्यताएं, दस्त, खालित्य, स्वाद विकारों, जीर्ण सूजन, और बिगड़ा प्रतिरक्षा और न्यूरोलॉजिकल कार्यों11,12, 13,14,15,16,17,18। अतिरिक्त में, zn साइटोटोक्सिक और अन्य आवश्यक धातुओं के impairs अवशोषण जैसे तांबे19,20,21है ।
इसके अतिरिक्त, कुछ धातुओं जैसे घन और Fe के लिए हानिकारक प्रतिक्रियाओं में भाग लेने की क्षमता है । प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन fenton रसायन विज्ञान के माध्यम से (ROS) लोहा सल्फर क्लस्टर प्रोटीन की विधानसभा के साथ हस्तक्षेप कर सकते है और लिपिड चयापचय में परिवर्तन22,23,24। इस नुकसान को रोकने के लिए, कोशिकाओं धातु बाध्यकारी chaperones और ट्रांसपोर्टरों विषाक्त प्रभाव को रोकने के लिए उपयोग । निस्संदेह, धातु homeostasis कसकर नियंत्रित किया जाना चाहिए सुनिश्चित करें कि विशिष्ट कोशिका प्रकार धातुओं के उचित स्तर बनाए रखने के लिए । इस कारण से, वहां जैविक नमूनों में ट्रेस धातुओं के सटीक मापन के लिए तकनीकों अग्रिम करने के लिए एक महत्वपूर्ण जरूरत है । विकसित और परिपक्व जीवों में सेलुलर स्तर पर तत्वों का पता लगाने के लिए एक विभेदक जैविक आवश्यकता है, विभिन्न विकासात्मक चरणों में, और सामान्य और रोग की स्थिति में. इसलिए, ऑर्गेनिमल मेटल होमियोस्टैसिस को समझने के लिए ऊतक और प्रणालीगत धातु स्तर का सटीक निर्धारण आवश्यक है ।
ग्रेफाइट फर्नेस परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोमेट्री (GF-एएएस) एक अति संवेदनशील तकनीक छोटे नमूना मात्रा के लिए प्रयोग किया जाता है, यह संक्रमण और जैविक और पर्यावरण के नमूनों में मौजूद भारी धातुओं को मापने के लिए आदर्श बना25,26 , 27 , 28. इसके अलावा, इस तकनीक की उच्च संवेदनशीलता के कारण, यह अच्छा परिवहन गुण Na+/k+-atpase और गैस्ट्रिक H+/K+-atpase xenopus का उपयोग एक मॉडल प्रणाली29के रूप में oocytes । जीएफ-एएएस में, नमूने के भीतर कणित तत्व, किसी प्रकाश स्रोत द्वारा उत्सर्जित विकिरण की तरंगदैर्घ्य को अवशोषित करते हैं जिसमें ब्याज की धातु होती है, अवशोषित विकिरण तत्व की सांद्रता के समानुपाती होते हैं । मौलिक इलेक्ट्रॉनिक उत्तेजना एक quantized प्रक्रिया में प्रत्येक रासायनिक तत्व के लिए अद्वितीय पराबैंगनी या दृश्य विकिरण के अवशोषण पर जगह लेता है. एक इलेक्ट्रॉन प्रक्रम में प़फ़ोटॉन के अवशोषण में इलेक्ट्रॉन निम्न ऊर्जा स्तर से उच्च स्तर तक गतिमान होकर परमाणु के भीतर होता है तथा जीएफ-एएएस नमूने द्वारा अवशोषित फोटॉनों की मात्रा का निर्धारण करता है, जो विकिरण अवशोषित करने की संख्या के समानुपातिक होता है । ग्रेफाइट ट्यूब में atomized तत्वों ।
इस तकनीक की चयनशीलता परमाणुओं की इलेक्ट्रॉनिक संरचना पर निर्भर करती है, जिसमें प्रत्येक तत्व में एक विशिष्ट अवशोषण/उत्सर्जन स्पेक्ट्रमी रेखा होती है । Zn के मामले में, अवशोषण तरंग दैर्ध्य २१३.९ एनएम है और ठीक अन्य धातुओं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है । कुल मिलाकर, GF-आस का पता लगाने की पर्याप्त सीमा (LOD) और उच्च संवेदनशीलता और चयनात्मकता25के साथ zn मात्रा को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अवशोषित तरंगदैर्घ्य में परिवर्तन को विशिष्ट एवं पृथक तरंगदैर्ध्य पर ऊर्जा अवशोषण की चोटियों के रूप में एकीकृत एवं प्रस्तुत किया जाता है । एक दिए गए नमूने में Zn की एकाग्रता आमतौर पर ज्ञात सांद्रता की एक मानक वक्र से बियर-Lambert कानून के अनुसार गणना की है, जिसमें अवशोषण सीधे नमूने में Zn की एकाग्रता के लिए आनुपातिक है । हालांकि, बियर-लैम्बर्ट समीकरण को GF-एएएस विश्लेषणों पर लागू करने से कुछ जटिलताएं भी पेश होती हैं । उदाहरण के लिए, नमूनों के परमाणीकरण और/या गैर-समरूप सांद्रता में भिन्नता धातु मापन को प्रभावित कर सकती है ।
धातु atomization GF आस ट्रेस मौलिक विश्लेषण के लिए आवश्यक तीन बुनियादी कदम होते हैं । पहला कदम है, जहां तरल विलायक evaporated है, उजालीकरण है; भट्ठी के बाद शुष्क यौगिकों छोड़ना लगभग १०० डिग्री सेल्सियस के तापमान तक पहुँचता है । फिर, यौगिकों उंहें ८०० से १,४०० डिग्री सेल्सियस के लिए हीटिंग द्वारा vaporized है (तत्व के आधार पर विश्लेषण किया जा करने के लिए) और एक गैस बन जाते हैं । अंत में, गैसीय अवस्था में यौगिक १,५०० से २,५०० ° ब् तक के तापमान के साथ कणित होते हैं । के रूप में ऊपर चर्चा की, ब्याज की एक धातु की सांद्रता में वृद्धि GF द्वारा पता लगाया अवशोषण पर आनुपातिक वृद्धि प्रदान करेगा-आस, अभी तक भट्ठी विश्लेषण के गतिशील रेंज है, जो सांद्रता है कि हो सकता है की काम रेंज कम कर देता है यंत्र द्वारा निर्धारित । इस प्रकार, तकनीक कम सांद्रता और lod और बियर-lambert कानून के रैखिकता (योग्य) की सीमा का निर्धारण करके विधि के गतिशील रेंज के एक सावधान दृढ़ संकल्प की आवश्यकता है । LOD एक पदार्थ के लिए आवश्यक ंयूनतम मात्रा का पता लगाया जा करने के लिए, मैट्रिक्स में Zn के मानक विचलन के तीन गुना के रूप में परिभाषित किया गया है । योग्य अधिकतम एकाग्रता है कि बियर-Lambert कानून का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है ।
इस काम में, हम एक मानक विधि का वर्णन करने के लिए पूरे सेल निष्कर्षों में Zn के स्तर का विश्लेषण, साइटोप्लाज्मिक और परमाणु भागों, और proliferating और सभ्य कोशिकाओं में फर्क (चित्रा 1). हम नमूना तैयार करने के दौरान धातु हानि को रोकने के लिए विभिन्न सेलुलर प्रणालियों के लिए नाभिक प्रोटोकॉल के तेजी से अलगाव अनुकूलित. प्रयुक्त सेलुलर मॉडल थे प्राथमिक myoblasts से व्युत्पन्न माउस सैटेलाइट कोशिकाओं, murine neuroblastoma कोशिकाओं (N2A या Neuro2A), murine 3T3 L1 आडीपोसाइट, एक मानव गैर-ट्यूमर स्तन उपकला कोशिका रेखा (MCF10A), और उपकला Madin-डार्की कैनाइन गुर्दे ( MDCK) कोशिकाओं । इन कोशिकाओं को विभिंन प्रजातियों से स्थापित किया गया और विट्रो मेंधातु के स्तर के वंश विशिष्ट विविधताओं की जांच के लिए अच्छे मॉडल हैं ।
माउस सैटेलाइट सेलों से व्युत्पन्न प्राथमिक मायोब्लास्ट कंकाल की मांसपेशी विभेदन की जांच करने के लिए एक अच्छी तरह से अनुकूल इन विट्रो मॉडल का गठन करते हैं । इन कोशिकाओं के प्रसार तेजी से जब उच्च सीरम शर्तों के तहत सभ्य है । मांसपेशी वंश में भिंनता है तो कम सीरम30शर्तों द्वारा प्रेरित है । मूरीन न्यूरोब्लास्टोमा (N2A) कोशिका रेखा की स्थापना माउस तंत्रिका शिखा से प्राप्त किया गया था । ये कोशिकाएं न्यूरोनल तथा अमीबोइड स्टेम कोशिका आकारिकी उपस्थित होती हैं । विभेदन उत्तेजना पर, N2A कोशिकाओं neurofilaments के रूप में इस तरह के ंयूरॉंस के कई गुण मौजूद हैं । N2A कोशिकाओं अल्जाइमर रोग की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है, neurite outgrowth, और neurotoxicity31,३२,३३. 3T3-L1 murine पूर्व-adipocytes सेल लाइन की स्थापना की आमतौर पर चयापचय और शारीरिक adipoउत्पत्ति के साथ जुड़े परिवर्तन की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इन कोशिकाओं को एक फाइटोब्लास्ट की तरह morphology वर्तमान, लेकिन एक बार भेदभाव के लिए प्रेरित, वे एंजाइमी लिपिड संश्लेषण और ट्राइग्लिसराइड्स संचय के साथ जुड़े सक्रियण वर्तमान. यह साइटोप्लाज्मिक लिपिड बूंदों३४,३५का उत्पादन करने के लिए रूपात्मक परिवर्तन के रूप में मनाया जा सकता है । MCF10A एक गैर ट्यूमर स्तन उपकला कोशिका स्तन फाइब्रोसिस्टिक रोग३६के साथ एक premenopausal औरत से व्युत्पंन लाइन है । यह व्यापक रूप से जैव रासायनिक, आणविक के लिए इस्तेमाल किया गया है, और सेलुलर अध्ययन, जैसे प्रसार, कोशिका प्रवास, और आक्रमण के रूप में स्तन कैंसरजनन से संबंधित. माइन-डार्द्वारा कैनाइन गुर्दा (एमडीकॉक) उपकला कोशिका लाइन को बड़े पैमाने पर उपकला phenotype की स्थापना के साथ जुड़े संपत्तियों और आणविक घटनाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । संगम तक पहुँचने पर, इन कोशिकाओं polarized हो जाते हैं और सेल-सेल आसंजन की स्थापना, स्तनधारियों उपकला ऊतकों की विशेषताओं३७.
आस की क्षमता का परीक्षण करने के लिए स्तनधारी कोशिकाओं में Zn के स्तर को मापने के लिए, हम पूरे और subcellular भागों (cytosol और नाभिक) इन पांच कोशिका लाइनों का विश्लेषण किया । आस माप इन सेल प्रकार में Zn के विभिंन सांद्रता दिखाया । प्राथमिक पेक्षप्रसू (प्रोटीन के 4 से 7 नामोल/मिग्रा) और चार स्थापित कोशिका रेखाओं (प्रोटीन के 20 से ४० तक के लिए) में उच्च की सांद्रता कम थी । जब कोशिकाओं का प्रसार करने की तुलना में प्राथमिक मायोब्लास्ट और न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं में अंतर करने में Zn स्तरों में एक छोटे से गैर-महत्वपूर्ण वृद्धि का पता चला । विभेदक ऐडिपोसाइट्स में विपरीत प्रभाव पाया गया । तथापि, 3T3-L1 कोशिकाओं में विभेदकारी कोशिकाओं की तुलना में धातु की उच्च सांद्रता प्रदर्शित होती है । महत्वपूर्ण बात, इन तीन सेल लाइनों में, subcellular प्रभाजन से पता चला कि zn विभेदन है cytosol और नाभिक में इन कोशिकाओं की चयापचय स्थिति के अनुसार वितरित की । उदाहरण के लिए, myoblasts, N2A कोशिकाओं, और 3T3-L1 पूर्व-adipocytes के प्रसार में, धातु के बहुमत नाभिक में स्थानीयकृत है । विशिष्ट कोशिका उपचार का उपयोग कर भेदभाव के प्रेरण पर, Zn इन तीन प्रकार के कोशिका में cytosol के लिए स्थानीयकृत । दिलचस्प बात यह है कि दोनों उपकला कोशिका रेखाओं ने प्रसार के दौरान Zn के उच्च स्तर को संगम तक पहुँचने की तुलना में दर्शाया, जिसमें एक विशेषता तंग मोनोलेयर का गठन किया गया था । उपकला कोशिकाओं के प्रसार में, स्तनधारी कोशिका रेखा में कोशिकासॉल और नाभिक के बीच समान Zn वितरण होता है, जबकि गुर्दे से व्युत्पन्न कोशिका रेखा में, अधिकांश धातु नाभिक में स्थित थी । इन दो प्रकार के कक्ष में, जब कोशिकाएं संगम पर पहुंचती हैं, तो Zn मुख्यतः सायकोसोल में स्थित होती है । इन परिणामों को प्रदर्शित करता है कि GF-आस कम उपज नमूनों में मौलिक विश्लेषण प्रदर्शन के लिए एक अत्यंत संवेदनशील और सटीक तकनीक है । GF-आस subcellular प्रभाजन के साथ युग्मित और विभिंन सेल लाइनों और ऊतकों में ट्रेस धातु तत्वों के स्तर की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
परमाण्विक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी एक अति संवेदनशील विधि है जो छोटे आयतन/जन जैविक नमूनों में Zn प्रमात्रीकरण के लिए है । Zn मापन का वर्णन अनुकूलन इस विधि के आवेदन सरल बनाता है और आदर्श विश्लेषणात्मक शर्त…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम संकाय विविधता स्कॉलर्स पुरस्कार से मैसाचुसेट्स मेडिकल स्कूल के T.P.-B विश्वविद्यालय से समर्थित था । N.N.-T. सितंबर-CONACYT द्वारा समर्थित है, २७९८७९ अनुदान । जे. जी. एन राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान DBI ०९५९४७६ द्वारा समर्थित है । लेखक डॉ डेरिल ए Bosco के लिए आभारी है N2A सेल लाइन प्रदान करने के लिए और Daniella Cangussu के लिए उसे तकनीकी सहायता के लिए ।
Materials
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma Aldrich | I5879 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1005706 | |
| Anti Brg1-antibody (G7) | Santa Cruz biotechnologies | sc-17796 | |
| Anti b-tubulin-antibody (BT7R) | Thermo Scientific | MA5-16308 | |
| Bradford | Biorad | 5000205 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) | ThermoFischer-Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) | ThermoFischer-Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFischer-Gibco | 14190144 | |
| Epidemal Growth Factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer-Gibco | 16000044 | |
| Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) | ThermoFischer-Gibco | PHG0024 | |
| Horse serum | ThermoFischer-Gibco | 16050122 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) | Sigma Aldrich | 95321 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-A | ThermoFischer | 51300044 | |
| Nitric Acid (HNO3) | Sigma Aldrich | 438073 | |
| Nonidet P-40 (NP-40) | Thermo Scientific | 85125 | |
| OptiMEM (Reduced Serum Media) | ThermoFischer-Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFischer-Gibco | 15140148 | |
| PureCol (Collagen) | Advanced BioMatrix | 5005 | |
| Retionic Acid | Sigma Aldrich | PHR1187 | |
| Troglitazone | Sigma Aldrich | 648469-M | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFischer-Gibco | 25200056 | |
| Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 | Perkin Elmer | N9300168 | |
| Established Cell Lines | |||
| 3T3-L1 | American Type Culture Collection | CL-173 | |
| MCDK | American Type Culture Collection | CCL-34 | |
| MCF10A | American Type Culture Collection | CRL-10317 | |
| N2A | American Type Culture Collection | CCL-131 | |
| Equipment | |||
| Atomic Absortion spectrophotometer | PerkinElmer | Aanalyst 800 | |
| Bioruptor | Diagnode | UCD-200 |
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