Atomabsorptionsspektroskopi til måling af intracellulære zink puljer i pattedyrsceller
Summary
Dyrkede primære eller etablerede cellelinjer anvendes almindeligvis til at behandle grundlæggende biologiske og mekanistiske spørgsmål som en indledende tilgang, før der anvendes dyremodeller. Denne protokol beskriver, hvordan man forbereder hele celleekstrakter og subcellulære fraktioner til undersøgelser af zink (Zn) og andre sporstoffer med atomabsorptionsspektroskopi.
Abstract
Overgangsmetaller er essentielle mikronæringsstoffer for organismer, men kan være giftige for celler ved høje koncentrationer ved at konkurrere med fysiologiske metaller i proteiner og generere redox stress. Patologiske tilstande, der fører til metaldepletering eller akkumulering, er kausale agenser af forskellige sygdomme hos mennesker. Nogle eksempler omfatter anæmi, acrodermatitis enteropatiica, og Wilson’s og Menkes ‘ sygdomme. Det er derfor vigtigt at kunne måle niveauerne og transporten af overgangsmetaller i biologiske prøver med høj følsomhed og nøjagtighed for at gøre det lettere at forske i, hvordan disse elementer bidrager til normale fysiologiske funktioner og Toksicitet. Zink (Zn), for eksempel, er en cofaktor i mange pattedyr proteiner, deltager i signalering begivenheder, og er en sekundær budbringer i celler. Overskydende, Zn er giftigt og kan hæmme absorption af andre metaller, mens i underskud, det kan føre til en række potentielt dødbringende betingelser.
Grafit ovn atomabsorptionsspektroskopi (GF-AAS) giver en meget følsom og effektiv metode til bestemmelse af Zn og andre Overgangsmetal koncentrationer i forskellige biologiske prøver. Elektro termisk forstøvning via GF-AAS kvantificerer metaller ved at forstøvning små mængder af prøver til efterfølgende selektiv absorption analyse ved hjælp af bølgelængde af excitation af elementet af interesse. Inden for grænserne af linearitet af øl-Lambert lov, absorbans af lys af metallet er direkte proportional med koncentrationen af analysand. Sammenlignet med andre metoder til bestemmelse af Zn-indhold registrerer GF-AAS både fri og kompleks bundet Zn i proteiner og muligvis i små intracellulære molekyler med høj følsomhed i små prøvevolumener. Desuden er GF-AAS også lettere tilgængelig end Induktivt koblet plasma massespektrometri (ICP-MS) eller synkrotron-baseret røntgen fluorescens. Ved denne metode beskrives den systematiske prøveforberedelse af forskellige dyrkede cellelinjer til analyser i en GF-AAS. Variationer i dette sporstof blev sammenlignet i både hele celle lysater og subcellulære fraktioner af prolifererende og differentierede celler som bevis for princippet.
Introduction
Overgang og tungmetaller, såsom Zn, cu, MN, og fe, findes naturligt i miljøet i både næringsstoffer i fødevarer og forurenende stoffer. Alle levende organismer kræver forskellige mængder af disse mikronæringsstoffer; eksponering for høje niveauer er imidlertid skadelig for organismer. Metal erhvervelse er hovedsageligt gennem kosten, men metaller kan også inhaleres eller absorberes gennem huden1,2,3,4,5. Det er vigtigt at bemærke, at tilstedeværelsen af metaller i atmosfæriske partikler er stigende og har været i vid udstrækning forbundet med sundhedsrisici. På grund af menneskeskabte aktiviteter er der påvist forhøjede niveauer af tungmetaller såsom AG, AS, cd, CR, HG, ni, fe og PB i atmosfæriske partikler, regnvand og jord6,7. Disse metaller har potentialet til at konkurrere med essentielle fysiologiske sporstoffer, især Zn og fe, og de fremkalder toksiske virkninger ved at inaktivere grundlæggende enzymer til biologiske processer.
Sporstoffet Zn er Redox neutral og opfører sig som en Lewis syre i biologiske reaktioner, hvilket gør det til en grundlæggende cofaktor nødvendig for proteinfoldning og katalytisk aktivitet i over 10% af pattedyrsproteiner8,9, 10og Bull. Derfor er det afgørende for forskellige fysiologiske funktioner8,11. Men ligesom mange sporstoffer, der er en hårfin balance mellem disse metaller letter normale fysiologiske funktion og forårsager toksicitet. I pattedyr, Zn mangler føre til anæmi, vækstretardering, hypogonadisme, hud abnormiteter, diarré, alopeci, smagsforstyrrelser, kronisk betændelse, og svækket immun og neurologiske funktioner11,12, 13,14,15,16,17,18. Overskydende, Zn er cytotoksisk og svækker absorptionen af andre essentielle metaller som kobber19,20,21.
Derudover, nogle metaller som cu og fe har potentiale til at deltage i skadelige reaktioner. Produktion af reaktive oxygenarter (ros) via Fenton Chemistry kan forstyrre samlingen af jern svovl klynge proteiner og ændre lipid metabolisme22,23,24. For at forhindre denne skade, celler udnytter metal-bindende chaperoner og transportører for at forhindre toksiske virkninger. Utvivlsomt, metal homøostase skal være stramt kontrolleret for at sikre, at specifikke celletyper opretholde passende niveauer af metaller. Af denne grund er der et betydeligt behov for at fremme teknikker til nøjagtig måling af spormetaller i biologiske prøver. I udviklings-og modne organismer findes der et differentieret biologisk behov for sporstoffer på celleniveau, på forskellige udviklingsstadier og under normale og patologiske forhold. Derfor er præcis bestemmelse af væv og systemiske metal niveauer er nødvendig for at forstå organismal metal homøostase.
Grafit ovn atomabsorptionsspektrometri (GF-AAS) er en meget følsom teknik, der anvendes til små prøvevolumener, hvilket gør den ideel til at måle overgang og tungmetaller til stede i biologiske og miljømæssige prøver25,26 , 27 stk. , 28. på grund af teknikkens høje følsomhed har det desuden vist sig at være hensigtsmæssigt at studere de fine transport egenskaber for Na+/K+-ATPase og gastrisk H+/k+-ATPase ved hjælp af xenopus oocytter som modelsystem29. I GF-AAS absorberer de forzinkede elementer i en prøve en bølgelængde af stråling, der udsendes af en lyskilde, der indeholder det metalliske stof, med den absorberede stråling proportional med koncentrationen af elementet. Elementært elektronisk excitation finder sted ved absorption af ultraviolet eller synlig stråling i en kvantiseret proces, der er unik for hvert kemisk element. I en enkelt elektron proces involverer optagelsen af en fotoner en elektron, der bevæger sig fra et lavere energi niveau til et højere niveau inden for atomet, og GF-AAS afgør, hvor meget fotoner der absorberes af prøven, hvilket er proportionalt med antallet af strålings absorberende elementer forstøvet i grafit røret.
Selektiviteten af denne teknik afhænger af den elektroniske struktur af atomerne, hvor hvert element har en specifik absorption/emission spektrallinje. For Zn er absorbansbølgelængden 213,9 nm og kan skelnes nøjagtigt fra andre metaller. Generelt kan GF-AAS anvendes til at kvantificere Zn med passende detektionsgrænser (LOD) og høj følsomhed og selektivitet25. Ændringerne i absorberet bølgelængde er integreret og præsenteret som toppe af energi absorption på specifikke og isolerede bølgelængder. Koncentrationen af Zn i en given prøve beregnes sædvanligvis ud fra en standardkurve med kendte koncentrationer i henhold til øl-Lambert-loven, hvor absorbansen er direkte proportional med koncentrationen af Zn i prøven. Men, anvendelse af Beer-Lambert ligning til GF-AAS analyser også præsenterer nogle komplikationer. For eksempel kan variationer i forstøvning og/eller ikke-homogene koncentrationer af prøverne påvirke metal målingerne.
Metal forstøvning kræves for GF AAS Trace elementært analyse består af tre grundlæggende trin. Det første skridt er desolvation, hvor det flydende opløsningsmiddel er fordampet; forlader tørre forbindelser efter ovnen når en temperatur på omkring 100 °C. Derefter, stofferne er fordampet ved opvarmning dem fra 800 til 1.400 °C (afhængigt af det element, der skal analyseres) og blive en gas. Endelig, de forbindelser i gasformige tilstand er forstøvet med temperaturer, der spænder fra 1.500 til 2.500 °C. Som nævnt ovenfor, stigende koncentrationer af et metal af interesse vil gøre proportionale stigninger på absorptionen detekteret af GF-AAS, men ovnen reducerer den dynamiske vifte af analyse, som er den arbejds række af koncentrationer, der kan være bestemmes af instrumentet. Således, teknikken kræver lave koncentrationer og en omhyggelig bestemmelse af det dynamiske område af metoden ved at bestemme LOD og grænse for linearitet (LOL) af øl-Lambert lov. LOD er den minimumsmængde, der kræves for et stof, der skal påvises, defineret som tre gange standardafvigelsen for Zn i matrixen. LOL er den maksimale koncentration, der kan påvises ved hjælp af øl-Lambert lov.
I dette arbejde, beskriver vi en standardmetode til at analysere niveauerne af Zn i hele celleekstrakter, cytoplasmatiske og nukleare fraktioner, og i prolifererende og differentiere kultiverede celler (figur 1). Vi tilpassede den hurtige isolation af kerner-protokollen til forskellige cellulære systemer for at forhindre metaltab under prøveforberedelse. De anvendte cellulære modeller var primære myoblaster afledt af mus satellit celler, murine neuroblastom celler (N2A eller Neuro2A), murine 3T3 L1 adipocytter, en human ikke-tumorigen bryst epitelial cellelinje (MCF10A), og epitelial Madin-Darby canine nyre ( MDCK-celler). Disse celler blev etableret fra forskellige slægter og er gode modeller til undersøgelse af Lineage specifikke variationer af metal niveauer in vitro.
Primære myoblaster afledt af mus satellit celler udgør en velegnet in vitro model til at undersøge skeletmuskulatur differentiering. Proliferation af disse celler er hurtig, når de dyrkes under høje serum betingelser. Differentiering i den muskulære Lineage er derefter induceret af lave serum betingelser30. Den murine neuroblastom (N2A) etablerede cellelinje blev afledt fra musen neurale crest. Disse celler præsenterer neuronal og amøboid stamcelle morfologi. Ved differentiering stimulus, de N2A celler præsentere flere egenskaber af neuroner, såsom Neuro filamenter. N2A celler bruges til at undersøge Alzheimers sygdom, neurite outgrowth, og neurotoksicitet31,32,33. 3T3-L1 murine præ-adipocytter etablerede cellelinje er almindeligt anvendt til at undersøge de metaboliske og fysiologiske ændringer forbundet med adipogenesis. Disse celler præsenterer en fibroblast-lignende morfologi, men når stimuleret til differentiering, de præsenterer enzymatisk aktivering forbundet med lipid syntese og triglycerider ophobning. Dette kan observeres som morfologiske ændringer for at producere cytoplasmatiske lipid dråber34,35. MCF10A er en ikke-tumor bryst epitelial cellelinje afledt af en præmenopausal kvinde med bryst fibrocystisk sygdom36. Det har været almindeligt anvendt til biokemiske, molekylære, og cellulære undersøgelser relateret til bryst carcinogenese såsom proliferation, celle migration, og invasion. Den Madin-Darby canine nyre (MDCK) epitelial cellelinje er blevet flittigt anvendt til at undersøge de egenskaber og molekylære hændelser i forbindelse med etableringen af epitelial fænotype. Ved at nå sammenløbet, disse celler bliver polariseret og etablere celle-celle klæbestoffer, karakteristika af pattedyr epitelial væv37.
For at teste AAS evne til at måle niveauerne af Zn i pattedyrceller, vi analyserede hele og subcellulære fraktioner (cytosol og kerne) af disse fem cellelinjer. AAS målinger viste forskellige koncentrationer af Zn i disse celletyper. Koncentrationerne var lavere i prolifererende og differentierende primære myoblaster (4 til 7 nmol/mg protein) og højere i de fire etablerede cellelinjer (fra 20 til 40 nmol/mg protein). En lille ikke-signifikant stigning i Zn niveauer blev påvist i differentiere primære myoblaster og neuroblastom celler sammenlignet med prolifererende celler. Den modsatte effekt blev påvist i differentierede adipocytter. Men, prolifererende 3T3-L1-celler udstillet højere koncentrationer af metallet i forhold til differentierede celler. Vigtigt, i disse tre cellelinjer, subcellulær fraktionering viste, at Zn er differentielt fordelt i cytosol og kerne i henhold til den metaboliske tilstand af disse celler. For eksempel, i prolifererende myoblaster, N2A celler, og 3T3-L1 præ-adipocytter, et flertal af metallet er lokaliseret til kernen. Ved induktion af differentiering ved hjælp af specifikke celle behandlinger, Zn lokaliseret til cytosol i disse tre celletyper. Interessant, begge epitel cellelinjer viste højere niveauer af Zn under proliferation i forhold til når man når sammenløbet, hvor en karakteristisk stram enkeltlags blev dannet. I prolifererende epitelceller, bryst cellelinje MCF10A havde en ligelig Zn fordeling mellem cytosol og kerne, mens i den nyre-afledte cellelinje, det meste af metallet var placeret i kernen. I disse to celletyper, når cellerne nåede sammenløbet, Zn var fortrinsvis placeret til cytosol. Disse resultater viser, at GF-AAS er en meget følsom og præcis teknik til udførelse af elementært analyse i lav-udbytte prøver. GF-AAS kombineret med subcellulær fraktionering og kan tilpasses til at undersøge niveauerne af spor metal elementer i forskellige cellelinjer og væv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Atomabsorptionsspektroskopi er en meget følsom metode til bestemmelse af Zn i små mængder/masse biologiske prøver. Den beskrevne optimering af Zn måling gør anvendelsen af denne metode enkel og garanterer ideelle analytiske betingelser. Her, ved hjælp af GF-AAS, vi bestemt koncentrationen af Zn i hele celler, og i cytosoliske og nukleare fraktioner, fra forskellige cellelinjer. Resultaterne viser, at denne teknik kan sammenlignes med den, der opnås ved fluorescerende sonder og ICP-MS. For eksempel, flere fluoresc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af fakultetet mangfoldighed Scholars Award fra University of Massachusetts Medical School til T.P.-B. N.N.-T. understøttes af SEP-CONACYT, tilskud 279879. J. G. N støttes af National Science Foundation Grant DBI 0959476. Forfatterne er taknemmelige for Dr. Daryl A. Bosco for at levere N2A celle linjen og til Daniella Cangussu for hendes tekniske support.
Materials
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma Aldrich | I5879 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1005706 | |
| Anti Brg1-antibody (G7) | Santa Cruz biotechnologies | sc-17796 | |
| Anti b-tubulin-antibody (BT7R) | Thermo Scientific | MA5-16308 | |
| Bradford | Biorad | 5000205 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) | ThermoFischer-Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) | ThermoFischer-Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFischer-Gibco | 14190144 | |
| Epidemal Growth Factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer-Gibco | 16000044 | |
| Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) | ThermoFischer-Gibco | PHG0024 | |
| Horse serum | ThermoFischer-Gibco | 16050122 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) | Sigma Aldrich | 95321 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-A | ThermoFischer | 51300044 | |
| Nitric Acid (HNO3) | Sigma Aldrich | 438073 | |
| Nonidet P-40 (NP-40) | Thermo Scientific | 85125 | |
| OptiMEM (Reduced Serum Media) | ThermoFischer-Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFischer-Gibco | 15140148 | |
| PureCol (Collagen) | Advanced BioMatrix | 5005 | |
| Retionic Acid | Sigma Aldrich | PHR1187 | |
| Troglitazone | Sigma Aldrich | 648469-M | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFischer-Gibco | 25200056 | |
| Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 | Perkin Elmer | N9300168 | |
| Established Cell Lines | |||
| 3T3-L1 | American Type Culture Collection | CL-173 | |
| MCDK | American Type Culture Collection | CCL-34 | |
| MCF10A | American Type Culture Collection | CRL-10317 | |
| N2A | American Type Culture Collection | CCL-131 | |
| Equipment | |||
| Atomic Absortion spectrophotometer | PerkinElmer | Aanalyst 800 | |
| Bioruptor | Diagnode | UCD-200 |
Riferimenti
- Sharma, B., Singh, S., Siddiqi, N. J. Biomedical implications of heavy metals induced imbalances in redox systems. Biomed Research International. 640754, (2014).
- Jaishankar, M., Tseten, T., Anbalagan, N., Mathew, B. B., Beeregowda, K. N. Toxicity, mechanism and health effects of some heavy metals. Interdisciplinary Toxicology. 7 (2), 60-72 (2014).
- Jan, A. T., et al. Heavy Metals and Human Health: Mechanistic Insight into Toxicity and Counter Defense System of Antioxidants. International Journal of Molecular Science. 16 (12), 29592-29630 (2015).
- Manutsewee, N., Aeungmaitrepirom, W., Varanusupakul, P., Imyim, A. Determination of Cd, Cu, and Zn in fish and mussel by AAS after ultrasound-assisted acid leaching extraction. Food Chemistry. 101 (2), 817-824 (2007).
- Pereira, C. C., de Souza, A. O., Oreste, E. Q., Vieira, M. A., Ribeiro, A. S. Evaluation of the use of a reflux system for sample preparation of processed fruit juices and subsequent determination of Cr, Cu, K, Mg, Na, Pb, and Zn by atomic spectrometry techniques. Food Chemistry. 240, 959-964 (2018).
- McComb, J. Q., Rogers, C., Han, F. X., Tchounwou, P. B. Rapid screening of heavy metals and trace elements in environmental samples using portable X-ray fluorescence spectrometer, A comparative study. Water, Air, & Soil Pollution. 225 (12), (2014).
- Borgatta, J. P., Paskavitz, A., Kim, D., Navea, J. G. Comparative evaluation of iron leach from different sources of fly ash under atmospherically relevant conditions. Environmental Chemistry. 13, 902-912 (2016).
- Dufner-Beattie, J., Langmade, S. J., Wang, F., Eide, D., Andrews, G. K. Structure, function, and regulation of a subfamily of mouse zinc transporter genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (50), 50142-50150 (2003).
- Sekler, I., Sensi, S. L., Hershfinkel, M., Silverman, W. F. Mechanism and regulation of cellular zinc transport. Molecular Medicine. 13 (7-8), 337-343 (2007).
- Berg, J. M., Shi, Y. The galvanization of biology: a growing appreciation for the roles of zinc. Science. 271 (5252), 1081-1085 (1996).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The Physiological, Biochemical, and Molecular Roles of Zinc Transporters in Zinc Homeostasis and Metabolism. Physiology Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Fukada, T., Kambe, T. Molecular and genetic features of zinc transporters in physiology and pathogenesis. Metallomics. 3 (7), 662-674 (2011).
- Prasad, A. S., Halsted, J. A., Nadimi, M. Syndrome of iron deficiency anemia, hepatosplenomegaly, hypogonadism, dwarfism and geophagia. American Journal of Medicine. 31, 532-546 (1961).
- Jinno, N., Nagata, M., Takahashi, T. Marginal zinc deficiency negatively affects recovery from muscle injury in mice. Biological Trace Element Research. 158 (1), 65-72 (2014).
- Gaither, L. A., Eide, D. J. Eukaryotic zinc transporters and their regulation. Biometals. 14 (3-4), 251-270 (2001).
- Fukada, T., Yamasaki, S., Nishida, K., Murakami, M., Hirano, T. Zinc homeostasis and signaling in health and diseases: Zinc signaling. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 16 (7), 1123-1134 (2011).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Plum, L. M., Rink, L., Haase, H. The essential toxin: impact of zinc on human health. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (4), 1342-1365 (2010).
- Broun, E. R., Greist, A., Tricot, G., Hoffman, R. Excessive zinc ingestion. A reversible cause of sideroblastic anemia and bone marrow depression. Journal of the American Medical Association. 264 (11), 1441-1443 (1990).
- Fischer, P. W., Giroux, A., L’Abbe, M. R. The effect of dietary zinc on intestinal copper absorption. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (9), 1670-1675 (1981).
- Ogiso, T., Ogawa, N., Miura, T. Inhibitory effect of high dietary zinc on copper absorption in rats. II. Binding of copper and zinc to cytosol proteins. in the intestinal mucosa. Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo. 27 (2), 515-521 (1979).
- Gaetke, L. M., Chow, C. K. Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients. Toxicology. 189 (1-2), 147-163 (2003).
- Macomber, L., Imlay, J. A. The iron-sulfur clusters of dehydratases are primary intracellular targets of copper toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8344-8349 (2009).
- Robotham, J. L., Lietman, P. S. Acute iron poisoning. A review. American Journal of Diseases of Children. 134 (9), 875-879 (1980).
- Yang, W., Ni, Z., Guang, P., Xue, Y., Guang, P., Fen, X. . Recent advances in absolute analysis by graphite furnace atomic absorption spectrometry. 17 (2), 104-110 (1997).
- Gomez-Nieto, B., Gismera, M. J., Sevilla, M. T., Satrustegui, J., Procopio, J. R. Micro-sampling method based on high-resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrometry for calcium determination in blood and mitochondrial suspensions. Talanta. 170, 15-21 (2017).
- Shaw, J. C., Bury, A. J., Barber, A., Mann, L., Taylor, A. A micromethod for the analysis of zinc in plasma or serum by atomic absorption spectrophotometry using graphite furnace. Clin Chim Acta. 118 (2-3), 229-239 (1982).
- Stevens, B. J., Hare, D. J., Volitakis, I., Cherny, R. A., Roberts, B. R. Direct determination of zinc in plasma by graphite furnace atomic absorption spectrometry using palladium/magnesium and EDTA matrix modification with high temperature pyrolysis. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 32 (4), 843-847 (2017).
- Durr, K. L., Tavraz, N. N., Spiller, S., Friedrich, T. Measuring cation transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus oocytes by atomic absorption spectrophotometry: an alternative to radioisotope assays. Journal of Visualized Experiments. (72), e50201 (2013).
- Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
- Salto, R., et al. beta-Hydroxy-beta-Methylbutyrate (HMB) Promotes Neurite Outgrowth in Neuro2a Cells. PLoS One. 10 (8), e0135614 (2015).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Provost, P. Interpretation and applicability of microRNA data to the context of Alzheimer’s and age-related diseases. Aging (Albany NY). 2 (3), 166-169 (2010).
- Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
- Padilla-Benavides, T., Velez-delValle, C., Marsch-Moreno, M., Castro-Munozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Lipogenic Enzymes Complexes and Cytoplasmic Lipid Droplet Formation During Adipogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2315-2326 (2016).
- Soule, H. D., et al. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Ricerca sul cancro. 50 (18), 6075-6086 (1990).
- Leighton, J., Estes, L. W., Mansukhani, S., Brada, Z. A cell line derived from normal dog kidney (MDCK) exhibiting qualities of papillary adenocarcinoma and of renal tubular epithelium. Cancer. 26 (5), 1022-1028 (1970).
- Cote, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
- Nabbi, A., Riabowol, K. Rapid Isolation of Nuclei from Cells In Vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (8), 769-772 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Carpenter, M. C., Lo, M. N., Palmer, A. E. Techniques for measuring cellular zinc. Archive of Biochemistry and Biophysics. 611, 20-29 (2016).
- Paskavitz, A. L., et al. Differential expression of zinc transporters accompanies the differentiation of C2C12 myoblasts. Journal of Trace Elements in Medical Biology. 49, 27-34 (2018).
- Chandler, P., et al. Subtype-specific accumulation of intracellular zinc pools is associated with the malignant phenotype in breast cancer. Molecular Cancer. 15 (2), (2016).
- Gordon, S. J. V., Fenker, D. E., Vest, K. E., Padilla-Benavides, T. Manganese influx and expression of ZIP8 is essential in primary myoblasts and contributes to activation of SOD2. bioRxiv. , 494542 (2018).
- Jansen, S., Arning, J., Beyersmann, D. Zinc homeostasis in C6 glioma cells: phospholipase C activity regulates cellular zinc export. Biological Trace Element Research. 108 (1-3), 87-104 (2005).
- Fahrni, C. J. Biological applications of X-ray fluorescence microscopy: exploring the subcellular topography and speciation of transition metals. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (2), 121-127 (2007).
- Huang, Z., Lippard, S. J. Illuminating mobile zinc with fluorescence from cuvettes to live cells and tissues. Methods in Enzymology. 505, 445-468 (2012).
- Qiao, W., Mooney, M., Bird, A. J., Winge, D. R., Eide, D. J. Zinc binding to a regulatory zinc-sensing domain monitored in vivo by using FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (23), 8674-8679 (2006).
- Tomat, E., Lippard, S. J. Imaging mobile zinc in biology. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 225-230 (2010).
- Jajda, H. M., et al. Comparative efficacy of two standard methods for determination of iron and zinc in fruits, pulses and cereals. Journal of Food Science and Technology. 52 (2), 1096-1102 (2015).
- Padilla-Benavides, T., Long, J. E., Raimunda, D., Sassetti, C. M., Argüello, J. M. A novel P1B-type Mn2+-transporting ATPase is required for secreted protein metallation in mycobacteria. Journal of Biological Chemistry. 288 (16), 11334-11347 (2013).
