Spectroscopie d’absorbance atomique pour mesurer les pools de zinc intracellulaire dans les cellules de mammifères
Summary
Les lignées cellulaires primaires ou établies sont couramment utilisées pour aborder les questions biologiques et mécanistiques fondamentales comme une approche initiale avant d’utiliser des modèles animaux. Ce protocole décrit comment préparer des extraits de cellules entières et des fractions subcellulaires pour des études de zinc (Zn) et d’autres oligo-éléments avec spectroscopie d’absorbance atomique.
Abstract
Les métaux de transition sont des micronutriments essentiels pour les organismes, mais peuvent être toxiques pour les cellules à fortes concentrations en rivalisant avec les métaux physiologiques dans les protéines et en générant un stress redox. Les conditions pathologiques qui conduisent à l’épuisement ou à l’accumulation de métaux sont des agents causaux de différentes maladies humaines. Quelques exemples incluent l’anémie, l’Acrodermatite Enteropathica, et les maladies de Wilson et de Menkes. Il est donc important de pouvoir mesurer les niveaux et le transport des métaux de transition dans des échantillons biologiques avec une sensibilité et une précision élevées afin de faciliter la recherche explorant comment ces éléments contribuent aux fonctions physiologiques normales et toxicité. Le zinc (Zn), par exemple, est un cofacteur dans de nombreuses protéines de mammifères, participe à des événements de signalisation, et est un messager secondaire dans les cellules. En excès, le Zn est toxique et peut inhiber l’absorption d’autres métaux, tandis que dans le déficit, il peut conduire à une variété de conditions potentiellement létales.
La spectroscopie d’absorption atomique du four à graphite (GF-AAS) fournit une méthode très sensible et efficace pour déterminer les concentrations de Zn et d’autres métaux de transition dans divers échantillons biologiques. L’atomisation électrothermique via GF-AAS quantifie les métaux en atomisant de petits volumes d’échantillons pour une analyse d’absorption sélective subséquente en utilisant la longueur d’onde d’excitation de l’élément d’intérêt. Dans les limites de la linéarité de la loi Beer-Lambert, l’absorbance de la lumière par le métal est directement proportionnelle à la concentration de l’analyte. Par rapport à d’autres méthodes de détermination de la teneur en Zn, GF-AAS détecte le Zn libre et complexé dans les protéines et peut-être dans de petites molécules intracellulaires avec une sensibilité élevée dans les petits volumes d’échantillons. De plus, le GF-AAS est aussi plus facilement accessible que la spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS) ou la fluorescence des rayons X à base de synchrotron. Dans cette méthode, on décrit la préparation systématique de l’échantillon de différentes lignées cellulaires cultivées pour les analyses dans un GF-AAS. Les variations de cet oligo-élément ont été comparées dans les lysats cellulaires entiers et les fractions subcellulaires des cellules proliférantes et différenciées comme preuve de principe.
Introduction
La transition et les métaux lourds, tels que le Zn, le Cu, le mn et le Fe, se retrouvent naturellement dans l’environnement dans les nutriments des aliments et des polluants. Tous les organismes vivants exigent des quantités différentes de ces micronutriments; Cependant, l’exposition à des niveaux élevés est délétère pour les organismes. L’acquisition de métaux est principalement par le biais de l’alimentation, mais les métaux peuvent également être inhalés ou absorbées par la peau1,2,3,4,5. Il est important de noter que la présence de métaux dans les particules atmosphériques augmente et a été largement associée à des risques pour la santé. En raison d’activités anthropiques, des niveaux accrus de métaux lourds tels que AG, As, CD, CR, Hg, ni, Fe et Pb ont été détectés dans les matières particulaires atmosphériques, l’eau de pluie et le sol6,7. Ces métaux ont le potentiel de rivaliser avec les oligo-éléments physiologiques essentiels, en particulier le Zn et le Fe, et ils induisent des effets toxiques en inactivant les enzymes fondamentales pour les processus biologiques.
L’oligo-élément Zn est neutre redox et se comporte comme un acide de Lewis dans les réactions biologiques, ce qui en fait un cofacteur fondamental nécessaire pour le pliage des protéines et l’activité catalytique dans plus de 10% des protéines de mammifères8,9, le 10; par conséquent, il est essentiel pour diverses fonctions physiologiques8,11. Cependant, comme de nombreux oligo-éléments, il y a un équilibre délicat entre ces métaux facilitant la fonction physiologique normale et causant la toxicité. Chez les mammifères, les carences en Zn conduisent à l’anémie, au retard de croissance, à l’hypogonadisme, aux anomalies cutanées, à la diarrhée, à l’alopécie, aux troubles du goût, à l’inflammation chronique et aux fonctions immunitaires et neurologiques altérées11,12, 13,14,15,16,17,18. En excès, le Zn est cytotoxique et altère l’absorption d’autres métaux essentiels tels que le cuivre19,20,21.
En outre, certains métaux comme Cu et Fe ont le potentiel de participer à des réactions nocives. La production d’espèces réactives d’oxygène (ROS) par l’intermédiaire de la chimie de Fenton peut interférer avec l’assemblage des protéines de grappe de soufre de fer et altérer le métabolisme lipidique22,23,24. Pour éviter ces dommages, les cellules utilisent des chaperons et des transporteurs à reliure métallique pour prévenir les effets toxiques. Sans aucun doute, l’homéostasie du métal doit être étroitement contrôlée pour s’assurer que les types de cellules spécifiques maintiennent des niveaux appropriés de métaux. Pour cette raison, il est important de faire progresser les techniques de mesure précise des métaux-traces dans les échantillons biologiques. Dans les organismes en développement et matures, il existe un besoin biologique différentiel pour les oligo-éléments au niveau cellulaire, à différents stades de développement, et dans des conditions normales et pathologiques. Par conséquent, une détermination précise des niveaux de tissu et de métal systémique est nécessaire pour comprendre l’homéostasie du métal organismique.
La spectrométrie d’absorption atomique du four à graphite (GF-AAS) est une technique très sensible utilisée pour les petits volumes d’échantillons, ce qui le rend idéal pour mesurer la transition et les métaux lourds présents dans les échantillons biologiques et environnementaux25,26 , 27 la plupart des , 28. en outre, en raison de la sensibilité élevée de la technique, il a été démontré qu’il était approprié pour étudier les propriétés de transport fines de Na+/K+-ATPase et gastrique H+/K+-ATPase utilisant Xenopus les ovocytes comme système modèle29. Dans GF-AAS, les éléments atomisés dans un échantillon absorbent une longueur d’onde de rayonnement émise par une source lumineuse contenant le métal d’intérêt, avec le rayonnement absorbé proportionnel à la concentration de l’élément. L’excitation électronique élémentaire se déroule lors de l’absorption de rayonnement ultraviolet ou visible dans un processus quantifié unique pour chaque élément chimique. Dans un processus d’électron unique, l’absorption d’un photon implique un électron passant d’un niveau d’énergie inférieur à un niveau supérieur dans l’atome et GF-AAS détermine la quantité de photons absorbé par l’échantillon, qui est proportionnelle au nombre de radiations absorbantes éléments atomisés dans le tube de graphite.
La sélectivité de cette technique repose sur la structure électronique des atomes, dans laquelle chaque élément a une ligne spectrale d’absorption/émission spécifique. Dans le cas du Zn, la longueur d’onde d’absorbance est 213,9 nm et peut être précisément distinguée des autres métaux. Dans l’ensemble, GF-AAS peut être utilisé pour quantifier le Zn avec des limites de détection adéquates (LOD) et une sensibilité et une sélectivité élevées25. Les changements dans la longueur d’onde absorbée sont intégrés et présentés comme des pics d’absorption d’énergie à des longueurs d’onde spécifiques et isolées. La concentration du Zn dans un échantillon donné est généralement calculée à partir d’une courbe standard de concentrations connues selon la loi Beer-Lambert, dans laquelle l’absorbance est directement proportionnelle à la concentration de Zn dans l’échantillon. Cependant, l’application de l’équation de Beer-Lambert aux analyses GF-AAS présente également quelques complications. Par exemple, les variations de l’atomisation et/ou des concentrations non homogènes des échantillons peuvent affecter les mesures du métal.
L’atomisation métallique requise pour l’analyse élémentaire de la trace de GF AAS se compose de trois étapes fondamentales. La première étape est la desolvation, où le solvant liquide est évaporé; laissant des composés secs après que le four atteigne une température d’environ 100 ° c. Ensuite, les composés sont vaporisés en les chauffant de 800 à 1 400 ° c (selon l’élément à analyser) et devenir un gaz. Enfin, les composés à l’état gazeux sont atomisés avec des températures allant de 1 500 à 2 500 ° c. Comme on l’a vu plus haut, les concentrations croissantes d’un métal d’intérêt rendraient les augmentations proportionnelles sur l’absorption détectée par le GF-AAS, mais le four réduit la gamme dynamique d’analyse, qui est la plage de travail des concentrations qui peuvent être déterminée par l’instrument. Ainsi, la technique exige de faibles concentrations et une détermination minutieuse de la gamme dynamique de la méthode en déterminant le LOD et la limite de linéarité (LOL) de la loi Beer-Lambert. Le LOD est la quantité minimale requise pour une substance à détecter, définie comme trois fois l’écart-type de Zn dans la matrice. Le LOL est la concentration maximale qui peut être détectée en utilisant la Loi de Beer-Lambert.
Dans ce travail, nous décrivons une méthode standard pour analyser les niveaux de Zn dans les extraits de cellules entières, les fractions cytoplasmiques et nucléaires, et dans les cellules cultivées proliférantes et différentiantes (figure 1). Nous avons adapté l’isolement rapide du protocole de noyaux à différents systèmes cellulaires pour éviter la perte de métal lors de la préparation de l’échantillon. Les modèles cellulaires utilisés étaient des myoblastes primaires dérivées de cellules de souris satellites, de cellules murines de neurones (n2a ou Neuro2a), de murin 3t3 L1 adipocytes, d’une lignée de cellules épithéliales non tumorigènes du sein (MCF10A) et d’un rein de chien épithélial Madin-Darby ( MDCK). Ces cellules ont été établies à partir de lignées différentes et sont de bons modèles pour étudier les variations spécifiques de la lignée des niveaux de métal in vitro.
Les myoblastes primaires dérivées des cellules satellites de souris constituent un modèle in vitro bien adapté pour étudier la différenciation musculaire squelettique. La prolifération de ces cellules est rapide lorsqu’elle est cultivée dans des conditions sériques élevées. La différenciation dans la lignée musculaire est ensuite induite par de faibles conditions sériques30. Le neuroblastome murin (N2A) a établi la lignée cellulaire a été dérivé de la crête neuronale de la souris. Ces cellules présentent une morphologie neuronale et amoeboïde des cellules souches. Lors du stimulus de différenciation, les cellules N2A présentent plusieurs propriétés des neurones, comme les neurofilaments. Les cellules n2a sont utilisées pour enquêter sur la maladie d’Alzheimer, l’outgrowth neurites et la neurotoxicité31,32,33. Les pré-adipocytes de la souris 3T3-L1 ont établi la lignée cellulaire est couramment utilisé pour étudier les changements métaboliques et physiologiques associés à l’adipogenèse. Ces cellules présentent une morphologie de fibroblastes, mais une fois stimulées pour la différenciation, elles présentent une activation enzymatique associée à la synthèse lipidique et à l’accumulation de triglycérides. Cela peut être observé comme des changements morphologiques pour produire des gouttelettes lipidiques cytoplasmiques34,35. MCF10A est une lignée de cellules épithéliales mammaires non tumorales dérivée d’une femme préménopausale atteinte de la maladie fibrokystique mammaire36. Il a été largement utilisé pour les études biochimiques, moléculaires et cellulaires liées à la carcinogenèse mammaire comme la prolifération, la migration cellulaire et l’invasion. La lignée de cellules épithéliales du rein canin de Madin-Darby (MDCK) a été largement utilisée pour étudier les propriétés et les événements moléculaires associés à l’établissement du phénotype épithélial. Après avoir atteint la confluence, ces cellules deviennent polarisées et établissent des adhérences cellulaires, caractéristiques des tissus épithéliaux de mammifères37.
Pour tester la capacité des AAS à mesurer les concentrations de Zn dans les cellules de mammifères, nous avons analysé des fractions entières et subcellulaires (cytosol et noyau) de ces cinq lignées cellulaires. Les mesures AAS ont montré différentes concentrations de Zn dans ces types de cellules. Les concentrations étaient plus faibles dans les myoblastes primaires proliférantes et différant (4 à 7 nmol/mg de protéine) et plus élevées dans les quatre lignées cellulaires établies (variant de 20 à 40 nmol/mg de protéine). Une petite augmentation non significative des concentrations de Zn a été détectée dans la différenciation des myoblastes primaires et des cellules neuroblatomes par rapport aux cellules proliférantes. L’effet inverse a été détecté dans les adipocytes différenciés. Cependant, la prolifération des cellules 3T3-L1 a montré des concentrations plus élevées du métal par rapport aux cellules différenciées. Il est important de noter que, dans ces trois lignées cellulaires, le fractionnement subcellulaire a montré que le Zn est distribué de façon différenciée dans le cytosol et le noyau en fonction de l’état métabolique de ces cellules. Par exemple, dans les myoblastes proliférantes, les cellules N2A et les pré-adipocytes 3T3-L1, une majorité du métal est localisée dans le noyau. Lors de l’induction de la différenciation à l’aide de traitements cellulaires spécifiques, Zn localisé au cytosol dans ces trois types de cellules. Fait intéressant, les deux lignées cellulaires épithéliales ont montré des niveaux plus élevés de Zn pendant la prolifération par rapport au moment d’atteindre la confluence, dans laquelle une monocouche étroite caractéristique a été formée. Dans les cellules épithéliales proliférantes, la lignée de cellules mammaires MCF10A avait une distribution de Zn égale entre le cytosol et le noyau, tandis que dans la lignée cellulaire dérivée du rein, la plupart des métaux étaient localisés dans le noyau. Dans ces deux types de cellules, lorsque les cellules atteignent la confluence, le Zn est principalement localisé au cytosol. Ces résultats démontrent que GF-AAS est une technique très sensible et précise pour effectuer des analyses élémentaires dans des échantillons à faible rendement. GF-AAS couplé avec fractionnement subcellulaire et peut être adapté pour étudier les niveaux d’oligo-éléments métalliques dans différentes lignées cellulaires et tissus.
Protocol
Representative Results
Discussion
La spectroscopie d’absorbance atomique est une méthode très sensible pour la quantification du Zn dans les petits échantillons biologiques de volume/masse. L’optimisation décrite de la mesure de Zn rend l’application de cette méthode simple et garantit des conditions analytiques idéales. Ici, en utilisant GF-AAS, nous avons déterminé la concentration de Zn dans les cellules entières, et dans les fractions cytosoliques et nucléaires, à partir de différentes lignées cellulaires. Les résultats montrent q…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été appuyé par le prix de la faculté de la diversité des chercheurs de l’Université de Massachusetts Medical School à la TP-B. N. T. est soutenue par SEP-CONACYT, Grant 279879. J. G. N est appuyé par la National Science Foundation Grant DBI 0959476. Les auteurs sont reconnaissants au Dr Daryl A. Bosco d’avoir fourni la lignée cellulaire N2A et à Daniella Cangussu pour son soutien technique.
Materials
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma Aldrich | I5879 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1005706 | |
| Anti Brg1-antibody (G7) | Santa Cruz biotechnologies | sc-17796 | |
| Anti b-tubulin-antibody (BT7R) | Thermo Scientific | MA5-16308 | |
| Bradford | Biorad | 5000205 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) | ThermoFischer-Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) | ThermoFischer-Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFischer-Gibco | 14190144 | |
| Epidemal Growth Factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer-Gibco | 16000044 | |
| Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) | ThermoFischer-Gibco | PHG0024 | |
| Horse serum | ThermoFischer-Gibco | 16050122 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) | Sigma Aldrich | 95321 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-A | ThermoFischer | 51300044 | |
| Nitric Acid (HNO3) | Sigma Aldrich | 438073 | |
| Nonidet P-40 (NP-40) | Thermo Scientific | 85125 | |
| OptiMEM (Reduced Serum Media) | ThermoFischer-Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFischer-Gibco | 15140148 | |
| PureCol (Collagen) | Advanced BioMatrix | 5005 | |
| Retionic Acid | Sigma Aldrich | PHR1187 | |
| Troglitazone | Sigma Aldrich | 648469-M | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFischer-Gibco | 25200056 | |
| Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 | Perkin Elmer | N9300168 | |
| Established Cell Lines | |||
| 3T3-L1 | American Type Culture Collection | CL-173 | |
| MCDK | American Type Culture Collection | CCL-34 | |
| MCF10A | American Type Culture Collection | CRL-10317 | |
| N2A | American Type Culture Collection | CCL-131 | |
| Equipment | |||
| Atomic Absortion spectrophotometer | PerkinElmer | Aanalyst 800 | |
| Bioruptor | Diagnode | UCD-200 |
Riferimenti
- Sharma, B., Singh, S., Siddiqi, N. J. Biomedical implications of heavy metals induced imbalances in redox systems. Biomed Research International. 640754, (2014).
- Jaishankar, M., Tseten, T., Anbalagan, N., Mathew, B. B., Beeregowda, K. N. Toxicity, mechanism and health effects of some heavy metals. Interdisciplinary Toxicology. 7 (2), 60-72 (2014).
- Jan, A. T., et al. Heavy Metals and Human Health: Mechanistic Insight into Toxicity and Counter Defense System of Antioxidants. International Journal of Molecular Science. 16 (12), 29592-29630 (2015).
- Manutsewee, N., Aeungmaitrepirom, W., Varanusupakul, P., Imyim, A. Determination of Cd, Cu, and Zn in fish and mussel by AAS after ultrasound-assisted acid leaching extraction. Food Chemistry. 101 (2), 817-824 (2007).
- Pereira, C. C., de Souza, A. O., Oreste, E. Q., Vieira, M. A., Ribeiro, A. S. Evaluation of the use of a reflux system for sample preparation of processed fruit juices and subsequent determination of Cr, Cu, K, Mg, Na, Pb, and Zn by atomic spectrometry techniques. Food Chemistry. 240, 959-964 (2018).
- McComb, J. Q., Rogers, C., Han, F. X., Tchounwou, P. B. Rapid screening of heavy metals and trace elements in environmental samples using portable X-ray fluorescence spectrometer, A comparative study. Water, Air, & Soil Pollution. 225 (12), (2014).
- Borgatta, J. P., Paskavitz, A., Kim, D., Navea, J. G. Comparative evaluation of iron leach from different sources of fly ash under atmospherically relevant conditions. Environmental Chemistry. 13, 902-912 (2016).
- Dufner-Beattie, J., Langmade, S. J., Wang, F., Eide, D., Andrews, G. K. Structure, function, and regulation of a subfamily of mouse zinc transporter genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (50), 50142-50150 (2003).
- Sekler, I., Sensi, S. L., Hershfinkel, M., Silverman, W. F. Mechanism and regulation of cellular zinc transport. Molecular Medicine. 13 (7-8), 337-343 (2007).
- Berg, J. M., Shi, Y. The galvanization of biology: a growing appreciation for the roles of zinc. Science. 271 (5252), 1081-1085 (1996).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The Physiological, Biochemical, and Molecular Roles of Zinc Transporters in Zinc Homeostasis and Metabolism. Physiology Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Fukada, T., Kambe, T. Molecular and genetic features of zinc transporters in physiology and pathogenesis. Metallomics. 3 (7), 662-674 (2011).
- Prasad, A. S., Halsted, J. A., Nadimi, M. Syndrome of iron deficiency anemia, hepatosplenomegaly, hypogonadism, dwarfism and geophagia. American Journal of Medicine. 31, 532-546 (1961).
- Jinno, N., Nagata, M., Takahashi, T. Marginal zinc deficiency negatively affects recovery from muscle injury in mice. Biological Trace Element Research. 158 (1), 65-72 (2014).
- Gaither, L. A., Eide, D. J. Eukaryotic zinc transporters and their regulation. Biometals. 14 (3-4), 251-270 (2001).
- Fukada, T., Yamasaki, S., Nishida, K., Murakami, M., Hirano, T. Zinc homeostasis and signaling in health and diseases: Zinc signaling. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 16 (7), 1123-1134 (2011).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Plum, L. M., Rink, L., Haase, H. The essential toxin: impact of zinc on human health. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (4), 1342-1365 (2010).
- Broun, E. R., Greist, A., Tricot, G., Hoffman, R. Excessive zinc ingestion. A reversible cause of sideroblastic anemia and bone marrow depression. Journal of the American Medical Association. 264 (11), 1441-1443 (1990).
- Fischer, P. W., Giroux, A., L’Abbe, M. R. The effect of dietary zinc on intestinal copper absorption. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (9), 1670-1675 (1981).
- Ogiso, T., Ogawa, N., Miura, T. Inhibitory effect of high dietary zinc on copper absorption in rats. II. Binding of copper and zinc to cytosol proteins. in the intestinal mucosa. Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo. 27 (2), 515-521 (1979).
- Gaetke, L. M., Chow, C. K. Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients. Toxicology. 189 (1-2), 147-163 (2003).
- Macomber, L., Imlay, J. A. The iron-sulfur clusters of dehydratases are primary intracellular targets of copper toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8344-8349 (2009).
- Robotham, J. L., Lietman, P. S. Acute iron poisoning. A review. American Journal of Diseases of Children. 134 (9), 875-879 (1980).
- Yang, W., Ni, Z., Guang, P., Xue, Y., Guang, P., Fen, X. . Recent advances in absolute analysis by graphite furnace atomic absorption spectrometry. 17 (2), 104-110 (1997).
- Gomez-Nieto, B., Gismera, M. J., Sevilla, M. T., Satrustegui, J., Procopio, J. R. Micro-sampling method based on high-resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrometry for calcium determination in blood and mitochondrial suspensions. Talanta. 170, 15-21 (2017).
- Shaw, J. C., Bury, A. J., Barber, A., Mann, L., Taylor, A. A micromethod for the analysis of zinc in plasma or serum by atomic absorption spectrophotometry using graphite furnace. Clin Chim Acta. 118 (2-3), 229-239 (1982).
- Stevens, B. J., Hare, D. J., Volitakis, I., Cherny, R. A., Roberts, B. R. Direct determination of zinc in plasma by graphite furnace atomic absorption spectrometry using palladium/magnesium and EDTA matrix modification with high temperature pyrolysis. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 32 (4), 843-847 (2017).
- Durr, K. L., Tavraz, N. N., Spiller, S., Friedrich, T. Measuring cation transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus oocytes by atomic absorption spectrophotometry: an alternative to radioisotope assays. Journal of Visualized Experiments. (72), e50201 (2013).
- Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
- Salto, R., et al. beta-Hydroxy-beta-Methylbutyrate (HMB) Promotes Neurite Outgrowth in Neuro2a Cells. PLoS One. 10 (8), e0135614 (2015).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Provost, P. Interpretation and applicability of microRNA data to the context of Alzheimer’s and age-related diseases. Aging (Albany NY). 2 (3), 166-169 (2010).
- Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
- Padilla-Benavides, T., Velez-delValle, C., Marsch-Moreno, M., Castro-Munozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Lipogenic Enzymes Complexes and Cytoplasmic Lipid Droplet Formation During Adipogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2315-2326 (2016).
- Soule, H. D., et al. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Ricerca sul cancro. 50 (18), 6075-6086 (1990).
- Leighton, J., Estes, L. W., Mansukhani, S., Brada, Z. A cell line derived from normal dog kidney (MDCK) exhibiting qualities of papillary adenocarcinoma and of renal tubular epithelium. Cancer. 26 (5), 1022-1028 (1970).
- Cote, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
- Nabbi, A., Riabowol, K. Rapid Isolation of Nuclei from Cells In Vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (8), 769-772 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Carpenter, M. C., Lo, M. N., Palmer, A. E. Techniques for measuring cellular zinc. Archive of Biochemistry and Biophysics. 611, 20-29 (2016).
- Paskavitz, A. L., et al. Differential expression of zinc transporters accompanies the differentiation of C2C12 myoblasts. Journal of Trace Elements in Medical Biology. 49, 27-34 (2018).
- Chandler, P., et al. Subtype-specific accumulation of intracellular zinc pools is associated with the malignant phenotype in breast cancer. Molecular Cancer. 15 (2), (2016).
- Gordon, S. J. V., Fenker, D. E., Vest, K. E., Padilla-Benavides, T. Manganese influx and expression of ZIP8 is essential in primary myoblasts and contributes to activation of SOD2. bioRxiv. , 494542 (2018).
- Jansen, S., Arning, J., Beyersmann, D. Zinc homeostasis in C6 glioma cells: phospholipase C activity regulates cellular zinc export. Biological Trace Element Research. 108 (1-3), 87-104 (2005).
- Fahrni, C. J. Biological applications of X-ray fluorescence microscopy: exploring the subcellular topography and speciation of transition metals. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (2), 121-127 (2007).
- Huang, Z., Lippard, S. J. Illuminating mobile zinc with fluorescence from cuvettes to live cells and tissues. Methods in Enzymology. 505, 445-468 (2012).
- Qiao, W., Mooney, M., Bird, A. J., Winge, D. R., Eide, D. J. Zinc binding to a regulatory zinc-sensing domain monitored in vivo by using FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (23), 8674-8679 (2006).
- Tomat, E., Lippard, S. J. Imaging mobile zinc in biology. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 225-230 (2010).
- Jajda, H. M., et al. Comparative efficacy of two standard methods for determination of iron and zinc in fruits, pulses and cereals. Journal of Food Science and Technology. 52 (2), 1096-1102 (2015).
- Padilla-Benavides, T., Long, J. E., Raimunda, D., Sassetti, C. M., Argüello, J. M. A novel P1B-type Mn2+-transporting ATPase is required for secreted protein metallation in mycobacteria. Journal of Biological Chemistry. 288 (16), 11334-11347 (2013).
