ספקטרוסקופיה לספיגה אטומית כדי למדוד בריכות אבץ תאיים בתאי מיונקים
Summary
קווי תאים ראשוניים או מבוססים משמשים בדרך כלל לטיפול בשאלות ביולוגיות ומכניסטיות בסיסיות כגישה ראשונית לפני השימוש במודלים של בעלי חיים. פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין תמציות תאים שלמות ושברים תת-סלולאריים למחקרים של אבץ (Zn) ורכיבי מעקב אחרים עם ספקטרוסקופיה לספיגת האטום.
Abstract
מתכות מעבר הם יסודות חיוניים לאורגניזמים אך יכולים להיות רעילים לתאים בריכוזים גבוהים על ידי התמודדות עם מתכות פיסיולוגיים בחלבונים ויצירת סטרס מחדש. מצבים פתולוגיים המובילים לדלדול מתכות או להצטברות הם סוכנים סיבתיים של מחלות אנושיות שונות. מספר דוגמאות כוללות אנמיה, אקרודרמטיטיס enteropathica, ווילסון ומחלות מנקס. לכן חשוב להיות מסוגל למדוד את רמות והובלה של מתכות מעבר בדגימות ביולוגיות עם רגישות גבוהה ודיוק על מנת להקל על המחקר לחקור כיצד גורמים אלה תורמים פונקציות פיזיולוגיות נורמלית רעילות. אבץ (Zn), למשל, הוא קופקטור במספר רב של חלבונים היונקים, משתתפת באירועים איתות, והוא שליח משני בתאים. בנוסף, Zn הוא רעיל והוא יכול לעכב את ספיגת מתכות אחרות, בעוד בגרעון, זה יכול להוביל למגוון של מצבים קטלניים פוטנציאלי.
התנור גרפיט ספקטרוסקופיית הקליטה האטומית (GF-AAS) מספק שיטה מאוד רגישה ויעילה לקביעת Zn ומעבר ריכוזי מתכת אחרים בדגימות ביולוגיות מגוונות. אלקטרוטרזציה האטומיות דרך GF-AAS ככמת מתכות על ידי הפחתת כמויות קטנות של דגימות עבור ניתוח בליעה סלקטיבית העוקבות באמצעות אורך הגל של עירור של אלמנט העניין. בגבולות היניאריות של חוק בירה-למברט, ספיגת האור על ידי המתכת מידתית באופן ישיר לריכוז האנליטה. לעומת שיטות אחרות של קביעת תוכן Zn, GF-AAS מזהה הן חינם, משלימה Zn בחלבונים ואולי במולקולות תאיים קטנות עם רגישות גבוהה בנפחים מדגם קטן. יתר על כן, GF-AAS הוא גם יותר נגיש בקלות מאשר השראה מצמידים פלזמה מסה מאסיבי (הקאמרי-MS) או סינכרוטרון-רנטגן מבוסס רנטגן. בשיטה זו, ההכנה לדוגמה שיטתית של קווי תאים מתורבתים שונים לניתוחים ב-GF-AAS מתוארת. וריאציות באלמנט מעקב זה הושוו בשני ליטים תא שלם ושברים subcellular של תאים מתרבים והבדיל כהוכחה לעיקרון.
Introduction
מעבר ומתכות כבדות, כגון Zn, Cu, Mn ו-Fe, נמצאים באופן טבעי בסביבה במזון ובחומרים מזהמים. כל האורגניזמים החיים דורשים כמויות שונות של יסודות אלה מיקרו; עם זאת, החשיפה לרמות גבוהות היא מדלטרזה לאורגניזמים. רכישת מתכת היא בעיקר דרך הדיאטה, אבל מתכות יכול גם להיות שאפה או נספג דרך העור1,2,3,4,5. חשוב לציין כי הנוכחות של מתכות חלקיקים אטמוספריים הוא הולך והיה קשור בעיקר לסיכונים בריאותיים. בשל פעילויות אנתרופוגניים, רמות גבוהות של מתכות כבדות כגון Ag, כמו, Cd, Cr, Hg, Ni, Fe, ו-Pb זוהו בחומר חלקיקי אטמוספרי, מי גשמים, ואדמה6,7. מתכות אלה יש פוטנציאל להתחרות עם אלמנטים פיסיולוגיים חיוניים, במיוחד Zn ו-Fe, והם לגרום להשפעות רעילות על ידי הפעלת אנזימים בסיסיים עבור תהליכים ביולוגיים.
אלמנט המעקב zn הוא הנייטרלי מחדש ומתנהג כחומצת לואיס בתגובות ביולוגיות, מה שהופך אותו לקופקטור בסיסי הנחוץ לקיפול חלבונים ולפעילות קטליטית ביותר מ -10% מהחלבונים המיונקים8,9, . עשר מטרים כתוצאה מכך, חיוני לפונקציות פיזיולוגיות שונות8,11. עם זאת, כמו יסודות קורט רבים, יש איזון עדין בין מתכות אלה הקלה על תפקוד פיזיולוגי נורמלי גרימת רעילות. ביונקים, zn הליקויים להוביל אנמיה, הצמיחה פיגור, hypogonadism, מומים בעור, שלשול, התקרחות, הפרעות טעם, דלקת כרונית, ולקויי פונקציות החיסון הנוירולוגי11,12, 13,14,15,16,17,18. עודף, zn הוא ציטוטוקסיים ופוגע בספיגה של מתכות חיוניות אחרות כגון נחושת19,20,21.
בנוסף, כמה מתכות כמו Cu ו-Fe יש את הפוטנציאל להשתתף בתגובות מזיקות. ייצור של מינים חמצן תגובתי (ROS) דרך פנטון כימיה יכול להפריע הרכבה של הברזל ברזל אשכול חלבונים לשנות את חילוף החומרים של השומנים22,23,24. כדי למנוע נזק זה, תאים לנצל מתכת מחייב המלווים ומובילים כדי למנוע אפקטים רעילים. ללא ספק, הומאוסטזיס מתכת חייב להיות נשלט הדוק כדי להבטיח כי סוגי תאים ספציפיים לשמור על רמות הנכון של מתכות. מסיבה זו, יש צורך משמעותי לקדם טכניקות למדידה מדויקת של מתכות קורט בדגימות ביולוגיות. בפיתוח ואורגניזמים בוגרים קיים צורך ביולוגי משלים ברכיבי מעקב ברמה התאית, בשלבים התפתחותיים שונים ובתנאים נורמליים ופתולוגיים. לכן, קביעת מדויק של רקמות ורמות מתכת מערכתית הוא הכרחי כדי להבין אורגאיהמחלת מתכת הומאוסטזיס.
התנור גרפיט האטום האטומי ספקטרומטריה (GF-AAS) היא טכניקה רגישה מאוד בשימוש עבור כרכים מדגם קטן, מה שהופך אותו אידיאלי כדי למדוד מעבר ומתכות כבדות להציג דגימות ביולוגיות וסביבתיות25,26 , בן 27 , 28. יתר על כן, בשל רגישות גבוהה של הטכניקה, זה הוכח להיות מתאים ללמוד את תכונות התחבורה קנס של Na+/k+-Atpase ואת הקיבה H+/k+-atpase באמצעות xenopus אוציטים כמערכת מודל29. ב GF-AAS, את האלמנטים האטומיים בתוך מדגם לקלוט אורך גל של קרינה הנפלטת על ידי מקור אור המכיל את מתכת הריבית, עם הקרינה נספג ביחס לריכוז של האלמנט. עירור האלקטרוני היסודות מתרחש על קליטת הקרינה אולטרה סגולה או לעין בתהליך כימות ייחודי עבור כל אלמנט כימי. בתהליך אלקטרון בודד, ספיגת הפוטון כרוכה באלקטרון העובר מרמת אנרגיה נמוכה יותר לרמה גבוהה יותר בתוך האטום ו-GF-AAS קובע את כמות הפוטונים שנספג על ידי המדגם, אשר פרופורציונאלית למספר קליטת הקרינה רכיבים האטומיזציה בשפופרת הגרפיט.
הסלקטיביות של טכניקה זו נשענת על המבנה האלקטרוני של האטומים, שבו כל אלמנט יש שורה מסוימת ספיגה/פליטת ספקטרלית. במקרה של Zn, אורך גל ספיגת הוא 213.9 ננומטר והוא יכול להיות מכובד בדיוק ממתכות אחרות. בסך הכל, GF-AAS יכול לשמש לכמת Zn עם גבולות נאותה של זיהוי (לוד) ורגישות גבוהה ובסלקטיביות25. השינויים באורך הגל הנספג משולבים ומוצגים כפסגות ספיגת אנרגיה באורכי גל ספציפיים ומבודדים. ריכוז Zn במדגם נתון מחושב בדרך כלל מתוך עיקול רגיל של ריכוזים ידועים על פי חוק בירה-למברט, שבו ספיגת הספיגה ביחס ישיר לריכוז Zn במדגם. עם זאת, החלת משוואת בירה למברט לניתוח GF-AAS גם מציג כמה סיבוכים. למשל, וריאציות בריכוזים האטומזציה ו/או הלא-הומוגניים של הדגימות יכולות להשפיע על מדידות המתכת.
האטווניזציה מתכת נדרש עבור הניתוח GF AAS מעקב היסודות מורכב משלושה צעדים יסודיים. הצעד הראשון הוא desolvation, שבו הממס הנוזלי מתאדה; השארת תרכובות יבשות לאחר שכבשן מגיע לטמפרטורה של כ-100 ° c. אז, תרכובות מתאדה על ידי חימום אותם מ 800 אל 1,400 ° צ’ (בהתאם לאלמנט להיות מנותח) ולהיות גז. לבסוף, התרכובות במצב גזי מאטובות בטמפרטורות הנעות בין 1,500 ל-2,500 ° c. כפי שנדונו לעיל, הגדלת ריכוזים של מתכת עניין יהיה להפוך מגדיל פרופורציונלי על ספיגת שזוהו על ידי GF-AAS, עדיין הכבשן מפחית את טווח דינמי של ניתוח, אשר הוא מגוון העבודה של ריכוזים שיכולים להיות נקבעת על-ידי הכלי. לפיכך, הטכניקה דורשת ריכוזים נמוכים ונחישות זהירה של הטווח הדינמי של השיטה על-ידי קביעת לוד והגבלת יניאריות (LOL) של חוק בירה-למברט. לוד הוא הכמות המינימלית הנדרשת לזיהוי חומר, המוגדר כפי שלושה מסטיית התקן של Zn במטריצה. LOL הוא הריכוז המקסימלי שניתן לזהות באמצעות חוק בירה-למברט.
בעבודה זו, אנו מתארים שיטה סטנדרטית לנתח את רמות Zn בתמציות תאים שלמים, cytoplasmic ושברים גרעיניים, ו בתוך מתרבים ומבדילים תאים מתורבתים (איור 1). התאמתי את הבידוד המהיר של פרוטוקול גרעיני למערכות סלולריות שונות כדי למנוע אובדן מתכת במהלך הכנת המדגם. הדגמים הסלולריים בשימוש היו myoblasts העיקרי נגזר מתאי לווין העכבר, מורנין בתאי נוירובלסטומה (N2A או Neuro2A), מורטין 3T3 L1 adipocytes, קו האפיתל של השד בן האדם (MCF10A), ו אפיתל דין-דארבי כליה הכלליים ( MDCK) תאים. תאים אלה הוקמו מתוך ליננים שונים הם מודלים טובים עבור חקירת וריאציות ספציפיות של השושלת של רמות מתכת מבחנה.
ראשי myoblasts נגזר מתאי לווין העכבר מהווים מתאים היטב מודל מבחנה לחקור בידול שריר השלד. התפשטות של תאים אלה הוא מהיר כאשר מתורבת בתנאי סרום גבוה. הבידול לתוך שושלת השרירים נגרמת לאחר מכן על ידי מצבים סרום נמוך30. נוירובלסטומה ממורין (N2A) הוקמה קו התא נגזר ציצה עצבי העכבר. תאים אלה מציגים מורפולוגיה של תאי גזע. ואמבות עם גירוי בידול, התאים הN2A להציג מספר תכונות של נוירונים, כגון הנוירוסיבים. N2A תאים משמשים כדי לחקור את מחלת האלצהיימר, neurite outgrowth, ו רעילות נוירו31,32,33. 3T3-L1 murine לפני adipocytes הוקמה קו התא משמש בדרך כלל כדי לחקור את השינויים מטבולית ופיסיולוגיים הקשורים adipocytes. תאים אלה להציג פיברוהפיצוץ כמו מורפולוגיה, אבל פעם מגורה עבור בידול, הם מציגים הפעלה אנזימטית הקשורים סינתזה השומנים הצטברות טריגליצרידים. זה יכול להיות נצפה כמו שינויים מורפולוגיים לייצר שומנים cytoplasmic טיפות34,35. MCF10A הוא קו האפיתל של החלב שאינם סרטניים שנגזר אישה טרום בגיל הסרטן עם מחלה פיברופיברוזיס של החלב36. הוא שימש רבות למחקרים ביוכימיים, מולקולריים וסלולאריים הקשורים לסרטן הפטמות, כגון התפשטות, העברת תאים ופלישה. דין-דארבי כליות הכלב (MDCK) הקו התא האפיתל השתמשו בהרחבה כדי לחקור את המאפיינים ואירועים מולקולריים הקשורים להקמת האפיתל פנוטיפים. בהגיעם למפגש, תאים אלה הופכים מקוטניים ומקימים הידקויות תא תא, מאפיינים של רקמות אפיתל מיונקים (37).
כדי לבדוק את היכולת של AAS למדוד את רמות Zn בתאי היונקים, ניתחנו שברים שלמים ו-subcellular (ציטוסול וגרעין) של חמש קווי תאים אלה. מדידות AAS הראה ריכוזים שונים של Zn בסוגי תאים אלה. ריכוזים היו נמוכים יותר בהתרבות ומבדילים העיקרי myoblasts (4 כדי 7 nmol/mg של חלבון) ומעלה בארבעה קווי התא הוקמה (החל מ 20 אל 40 nmol/mg של חלבון). קטן לא משמעותי עלייה ברמות Zn זוהה בהבחנה הראשי myoblasts ובתאי נוירובלסטומה בהשוואה לתאים מתרבים. האפקט המנוגד זוהה adipocytes הבדיל. עם זאת, מתרבים 3T3-L1 תאים הציגו ריכוזים גבוהים יותר של המתכת לעומת תאים הבדיל. וחשוב מכך, בשלושת קווי התאים האלה, שבירה משנית הראתה כי Zn הוא מופץ באופן מהותי בציטוסול ובגרעין לפי מצב חילוף החומרים של תאים אלה. למשל, ב מתרבים myoblasts N2A תאים, ו 3T3-L1 טרום-adipocytes, רוב המתכת היא מקומית לגרעין. עם אינדוקציה של בידול באמצעות טיפולי תאים ספציפיים, Zn מקומי הציטוזול בשלושת סוגי תאים אלה. מעניין, שני קווי האפיתל הראו רמות גבוהות יותר של Zn במהלך התפשטות לעומת כאשר הגיע המפגש, שבו נוצר מונאולייר הדוק מאפיין. בתאי האפיתל מתרבים, קו החלב MCF10A היה התפלגות Zn שווה בין הציטוסול והגרעין, בעוד בתוך קו הכליה-נגזר התאים, רוב המתכת היתה ממוקמת בגרעין. בשני סוגי תאים אלה, כאשר התאים הגיעו למפגש, Zn היה ממוקם בעיקר לציטוסול. תוצאות אלה מוכיחים כי GF-AAS היא טכניקה רגישה מאוד מדויק לביצוע ניתוח אלמנטלים בדגימות תשואה נמוכה. GF-AAS בשילוב עם השבר הסלולר והוא יכול להיות מותאם כדי לחקור את הרמות של מעקב רכיבי מתכת קווי תאים שונים ורקמות.
Protocol
Representative Results
Discussion
ספקטרוסקופית בליעה אטומית היא שיטה רגישה ביותר עבור כימות Zn בדגימות ביולוגיות קטנות של נפח/המוני. אופטימיזציה תיאר של Zn מדידה עושה יישום של שיטה זו פשוטה ערבויות תנאים אנליטיים אידיאליים. כאן, באמצעות GF-AAS, קבענו ריכוז של Zn בתאים שלמים, ו ציטוסולג ושברים גרעיניים, מקווי תאים שונים. התוצאות ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היתה נתמכת על ידי פרס מגוון הפקולטה מאוניברסיטת מסצ בית הספר לרפואה ט-B. N.N.-טי. נתמך על ידי ספ-CONACYT, גרנט 279879. J. G. N נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע המענק DBI 0959476. המחברים אסירי תודה לד ר דריל א. בוסקו לאספקת הקו הN2A לדניאלה Cangussu לתמיכה הטכנית שלה.
Materials
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma Aldrich | I5879 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1005706 | |
| Anti Brg1-antibody (G7) | Santa Cruz biotechnologies | sc-17796 | |
| Anti b-tubulin-antibody (BT7R) | Thermo Scientific | MA5-16308 | |
| Bradford | Biorad | 5000205 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) | ThermoFischer-Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) | ThermoFischer-Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFischer-Gibco | 14190144 | |
| Epidemal Growth Factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer-Gibco | 16000044 | |
| Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) | ThermoFischer-Gibco | PHG0024 | |
| Horse serum | ThermoFischer-Gibco | 16050122 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) | Sigma Aldrich | 95321 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-A | ThermoFischer | 51300044 | |
| Nitric Acid (HNO3) | Sigma Aldrich | 438073 | |
| Nonidet P-40 (NP-40) | Thermo Scientific | 85125 | |
| OptiMEM (Reduced Serum Media) | ThermoFischer-Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFischer-Gibco | 15140148 | |
| PureCol (Collagen) | Advanced BioMatrix | 5005 | |
| Retionic Acid | Sigma Aldrich | PHR1187 | |
| Troglitazone | Sigma Aldrich | 648469-M | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFischer-Gibco | 25200056 | |
| Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 | Perkin Elmer | N9300168 | |
| Established Cell Lines | |||
| 3T3-L1 | American Type Culture Collection | CL-173 | |
| MCDK | American Type Culture Collection | CCL-34 | |
| MCF10A | American Type Culture Collection | CRL-10317 | |
| N2A | American Type Culture Collection | CCL-131 | |
| Equipment | |||
| Atomic Absortion spectrophotometer | PerkinElmer | Aanalyst 800 | |
| Bioruptor | Diagnode | UCD-200 |
Riferimenti
- Sharma, B., Singh, S., Siddiqi, N. J. Biomedical implications of heavy metals induced imbalances in redox systems. Biomed Research International. 640754, (2014).
- Jaishankar, M., Tseten, T., Anbalagan, N., Mathew, B. B., Beeregowda, K. N. Toxicity, mechanism and health effects of some heavy metals. Interdisciplinary Toxicology. 7 (2), 60-72 (2014).
- Jan, A. T., et al. Heavy Metals and Human Health: Mechanistic Insight into Toxicity and Counter Defense System of Antioxidants. International Journal of Molecular Science. 16 (12), 29592-29630 (2015).
- Manutsewee, N., Aeungmaitrepirom, W., Varanusupakul, P., Imyim, A. Determination of Cd, Cu, and Zn in fish and mussel by AAS after ultrasound-assisted acid leaching extraction. Food Chemistry. 101 (2), 817-824 (2007).
- Pereira, C. C., de Souza, A. O., Oreste, E. Q., Vieira, M. A., Ribeiro, A. S. Evaluation of the use of a reflux system for sample preparation of processed fruit juices and subsequent determination of Cr, Cu, K, Mg, Na, Pb, and Zn by atomic spectrometry techniques. Food Chemistry. 240, 959-964 (2018).
- McComb, J. Q., Rogers, C., Han, F. X., Tchounwou, P. B. Rapid screening of heavy metals and trace elements in environmental samples using portable X-ray fluorescence spectrometer, A comparative study. Water, Air, & Soil Pollution. 225 (12), (2014).
- Borgatta, J. P., Paskavitz, A., Kim, D., Navea, J. G. Comparative evaluation of iron leach from different sources of fly ash under atmospherically relevant conditions. Environmental Chemistry. 13, 902-912 (2016).
- Dufner-Beattie, J., Langmade, S. J., Wang, F., Eide, D., Andrews, G. K. Structure, function, and regulation of a subfamily of mouse zinc transporter genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (50), 50142-50150 (2003).
- Sekler, I., Sensi, S. L., Hershfinkel, M., Silverman, W. F. Mechanism and regulation of cellular zinc transport. Molecular Medicine. 13 (7-8), 337-343 (2007).
- Berg, J. M., Shi, Y. The galvanization of biology: a growing appreciation for the roles of zinc. Science. 271 (5252), 1081-1085 (1996).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The Physiological, Biochemical, and Molecular Roles of Zinc Transporters in Zinc Homeostasis and Metabolism. Physiology Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Fukada, T., Kambe, T. Molecular and genetic features of zinc transporters in physiology and pathogenesis. Metallomics. 3 (7), 662-674 (2011).
- Prasad, A. S., Halsted, J. A., Nadimi, M. Syndrome of iron deficiency anemia, hepatosplenomegaly, hypogonadism, dwarfism and geophagia. American Journal of Medicine. 31, 532-546 (1961).
- Jinno, N., Nagata, M., Takahashi, T. Marginal zinc deficiency negatively affects recovery from muscle injury in mice. Biological Trace Element Research. 158 (1), 65-72 (2014).
- Gaither, L. A., Eide, D. J. Eukaryotic zinc transporters and their regulation. Biometals. 14 (3-4), 251-270 (2001).
- Fukada, T., Yamasaki, S., Nishida, K., Murakami, M., Hirano, T. Zinc homeostasis and signaling in health and diseases: Zinc signaling. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 16 (7), 1123-1134 (2011).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Plum, L. M., Rink, L., Haase, H. The essential toxin: impact of zinc on human health. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (4), 1342-1365 (2010).
- Broun, E. R., Greist, A., Tricot, G., Hoffman, R. Excessive zinc ingestion. A reversible cause of sideroblastic anemia and bone marrow depression. Journal of the American Medical Association. 264 (11), 1441-1443 (1990).
- Fischer, P. W., Giroux, A., L’Abbe, M. R. The effect of dietary zinc on intestinal copper absorption. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (9), 1670-1675 (1981).
- Ogiso, T., Ogawa, N., Miura, T. Inhibitory effect of high dietary zinc on copper absorption in rats. II. Binding of copper and zinc to cytosol proteins. in the intestinal mucosa. Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo. 27 (2), 515-521 (1979).
- Gaetke, L. M., Chow, C. K. Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients. Toxicology. 189 (1-2), 147-163 (2003).
- Macomber, L., Imlay, J. A. The iron-sulfur clusters of dehydratases are primary intracellular targets of copper toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8344-8349 (2009).
- Robotham, J. L., Lietman, P. S. Acute iron poisoning. A review. American Journal of Diseases of Children. 134 (9), 875-879 (1980).
- Yang, W., Ni, Z., Guang, P., Xue, Y., Guang, P., Fen, X. . Recent advances in absolute analysis by graphite furnace atomic absorption spectrometry. 17 (2), 104-110 (1997).
- Gomez-Nieto, B., Gismera, M. J., Sevilla, M. T., Satrustegui, J., Procopio, J. R. Micro-sampling method based on high-resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrometry for calcium determination in blood and mitochondrial suspensions. Talanta. 170, 15-21 (2017).
- Shaw, J. C., Bury, A. J., Barber, A., Mann, L., Taylor, A. A micromethod for the analysis of zinc in plasma or serum by atomic absorption spectrophotometry using graphite furnace. Clin Chim Acta. 118 (2-3), 229-239 (1982).
- Stevens, B. J., Hare, D. J., Volitakis, I., Cherny, R. A., Roberts, B. R. Direct determination of zinc in plasma by graphite furnace atomic absorption spectrometry using palladium/magnesium and EDTA matrix modification with high temperature pyrolysis. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 32 (4), 843-847 (2017).
- Durr, K. L., Tavraz, N. N., Spiller, S., Friedrich, T. Measuring cation transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus oocytes by atomic absorption spectrophotometry: an alternative to radioisotope assays. Journal of Visualized Experiments. (72), e50201 (2013).
- Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
- Salto, R., et al. beta-Hydroxy-beta-Methylbutyrate (HMB) Promotes Neurite Outgrowth in Neuro2a Cells. PLoS One. 10 (8), e0135614 (2015).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Provost, P. Interpretation and applicability of microRNA data to the context of Alzheimer’s and age-related diseases. Aging (Albany NY). 2 (3), 166-169 (2010).
- Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
- Padilla-Benavides, T., Velez-delValle, C., Marsch-Moreno, M., Castro-Munozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Lipogenic Enzymes Complexes and Cytoplasmic Lipid Droplet Formation During Adipogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2315-2326 (2016).
- Soule, H. D., et al. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Ricerca sul cancro. 50 (18), 6075-6086 (1990).
- Leighton, J., Estes, L. W., Mansukhani, S., Brada, Z. A cell line derived from normal dog kidney (MDCK) exhibiting qualities of papillary adenocarcinoma and of renal tubular epithelium. Cancer. 26 (5), 1022-1028 (1970).
- Cote, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
- Nabbi, A., Riabowol, K. Rapid Isolation of Nuclei from Cells In Vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (8), 769-772 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Carpenter, M. C., Lo, M. N., Palmer, A. E. Techniques for measuring cellular zinc. Archive of Biochemistry and Biophysics. 611, 20-29 (2016).
- Paskavitz, A. L., et al. Differential expression of zinc transporters accompanies the differentiation of C2C12 myoblasts. Journal of Trace Elements in Medical Biology. 49, 27-34 (2018).
- Chandler, P., et al. Subtype-specific accumulation of intracellular zinc pools is associated with the malignant phenotype in breast cancer. Molecular Cancer. 15 (2), (2016).
- Gordon, S. J. V., Fenker, D. E., Vest, K. E., Padilla-Benavides, T. Manganese influx and expression of ZIP8 is essential in primary myoblasts and contributes to activation of SOD2. bioRxiv. , 494542 (2018).
- Jansen, S., Arning, J., Beyersmann, D. Zinc homeostasis in C6 glioma cells: phospholipase C activity regulates cellular zinc export. Biological Trace Element Research. 108 (1-3), 87-104 (2005).
- Fahrni, C. J. Biological applications of X-ray fluorescence microscopy: exploring the subcellular topography and speciation of transition metals. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (2), 121-127 (2007).
- Huang, Z., Lippard, S. J. Illuminating mobile zinc with fluorescence from cuvettes to live cells and tissues. Methods in Enzymology. 505, 445-468 (2012).
- Qiao, W., Mooney, M., Bird, A. J., Winge, D. R., Eide, D. J. Zinc binding to a regulatory zinc-sensing domain monitored in vivo by using FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (23), 8674-8679 (2006).
- Tomat, E., Lippard, S. J. Imaging mobile zinc in biology. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 225-230 (2010).
- Jajda, H. M., et al. Comparative efficacy of two standard methods for determination of iron and zinc in fruits, pulses and cereals. Journal of Food Science and Technology. 52 (2), 1096-1102 (2015).
- Padilla-Benavides, T., Long, J. E., Raimunda, D., Sassetti, C. M., Argüello, J. M. A novel P1B-type Mn2+-transporting ATPase is required for secreted protein metallation in mycobacteria. Journal of Biological Chemistry. 288 (16), 11334-11347 (2013).
