Espectroscopia de absorvância atômica para medir piscinas de zinco intracelular em células de mamíferos

Summary

Linhas celulares primárias ou estabelecidas cultivadas são comumente usadas para abordar questões biológicas e mecanísticas fundamentais como uma abordagem inicial antes de usar modelos animais. Este protocolo descreve como preparar extratos de células inteiras e frações subcelulares para estudos de zinco (Zn) e outros oligoelementos com espectroscopia de absorvância atômica.

Abstract

Os metais de transição são micronutrientes essenciais para os organismos, mas podem ser tóxicos para as células em altas concentrações, competindo com metais fisiológicos em proteínas e gerando estresse redox. As condições patológicas que levam à depleção ou acúmulo de metal são agentes causais de diferentes doenças humanas. Alguns exemplos incluem anemia, Acrodermatite enteropática, e as doenças de Wilson e Menkes. Portanto, é importante poder medir os níveis e o transporte de metais de transição em amostras biológicas com alta sensibilidade e precisão, a fim de facilitar a pesquisa explorando como esses elementos contribuem para as funções fisiológicas normais e Toxicidade. O zinco (Zn), por exemplo, é um cofator em muitas proteínas de mamíferos, participa em eventos de sinalização, e é um mensageiro secundário nas pilhas. Em excesso, Zn é tóxico e pode inibir a absorção de outros metais, enquanto no déficit, pode levar a uma variedade de condições potencialmente letais.

A espectroscopia de absorção atômica do forno de grafite (GF-AAS) fornece um método altamente sensível e efetivo para a determinação de Zn e outras concentrações metálicas de transição em diversas amostras biológicas. A atomização Eletrotérmica via GF-AAS quantifica metais por atomização de pequenos volumes de amostras para posterior análise seletiva de absorção usando o comprimento de onda da excitação do elemento de interesse. Dentro dos limites da linearidade da lei Beer-Lambert, a absorvância da luz pelo metal é diretamente proporcional à concentração do analito. Comparado a outros métodos de determinação do teor de Zn, o GF-AAS detecta Zn livre e complexado em proteínas e possivelmente em pequenas moléculas intracelulares com alta sensibilidade em pequenos volumes amostrais. Além disso, GF-AAS também é mais prontamente acessível do que a espectrometria de massa plasmática indutivamente acoplada (ICP-MS) ou fluorescência de raios-X à base de síncrotron. Neste método, descreve-se a preparação sistemática de amostras de diferentes linhagens de células cultivadas para análises em GF-AAS. As variações neste elemento de traço foram comparadas em lysates inteiros da pilha e em frações subcellular de pilhas proliferating e diferenciadas como a prova do princípio.

Introduction

A transição e os metais pesados, como Zn, UC, MN e Fe, são encontrados naturalmente no ambiente em ambos os nutrientes em alimentos e poluentes. Todos os organismos vivos necessitam de diferentes quantidades destes micronutrientes; no entanto, a exposição a níveis elevados é deletério para os organismos. A aquisição de metais é principalmente através da dieta, mas os metais também podem ser inalados ou absorvidos pela pele^1,2,3,4,5. É importante notar que a presença de metais em partículas atmosféricas está aumentando e tem sido largamente associada a riscos para a saúde. Devido às atividades antropogênicas, o aumento dos níveis de metais pesados como o AG, as, CD, CR, Hg, Ni, Fe e PB foram detectados em material particulado atmosférico, água da chuva e solo^6,7. Estes metais têm o potencial de competir com oligoelementos fisiológicos essenciais, particularmente Zn e Fe, e induzem efeitos tóxicos pela inativação de enzimas fundamentais para processos biológicos.

O elemento traço Zn é redox neutro e se comporta como um ácido de Lewis em reações biológicas, o que o torna um cofator fundamental necessário para a dobradura de proteínas e atividade catalítica em mais de 10% das proteínas de mamíferos^{8,9, de 10}; Conseqüentemente, é essencial para diversas funções fisiológicas^8,11. No entanto, como muitos oligoelementos, há um equilíbrio delicado entre estes metais facilitando a função fisiológica normal e causando toxicidade. Em mamíferos, as deficiências de Zn levam à anemia, retardo de crescimento, hipogonadismo, anormalidades cutâneas, diarréia, alopecia, distúrbios do paladar, inflamação crônica e funções imunes e neurológicas comprometidas^{11,12, 13,14,15,16,17,18}. Em excesso, o Zn é citotóxico e prejudica a absorção de outros metais essenciais como o cobre^19,20,21.

Adicionalmente, alguns metais como o UC e o FE têm o potencial para participar em reações prejudiciais. A produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) via química de Fenton pode interferir com a montagem de proteínas cluster de enxofre de ferro e alterar o metabolismo lipídico^22,23,24. Para evitar este dano, as células utilizam chaperonas de ligação metálica e transportadores para evitar efeitos tóxicos. Indubitàvelmente, a homeostase do metal deve ser controlada firmemente para assegurar-se de que os tipos específicos da pilha mantenham níveis apropriados de metais. Por este motivo, há uma necessidade significativa de avançar técnicas para a medida exata de metais de traço em amostras biológicas. Em desenvolver e em organismos maduros existe uma necessidade biológica diferencial para oligoelementos no nível celular, em estágios desenvolventes diferentes, e em circunstâncias normais e patológicas. Conseqüentemente, a determinação precisa de níveis do tecido e do metal sistemático é necessária para compreender a homeostase do metal do organismo.

A espectrometria de absorção atômica da fornalha da grafita (GF-AAS) é uma técnica altamente sensível usada para volumes pequenos da amostra, fazendo o ideal medir a transição e os metais pesados atuais em amostras biológicas e ambientais^{25,26 , 27} anos de ^{, 28}. Além disso, devido à alta sensibilidade da técnica, demonstrou-se apropriado para o estudo das propriedades de transporte fino de na⁺/K⁺-ATPase e H⁺/k⁺-ATPase gástrica usando Xenopus Os oócitos como um sistema modelo²⁹. Em GF-AAS, os elementos atomizados dentro de uma amostra absorvem um comprimento de onda de radiação emitida por uma fonte luminosa contendo o metal de interesse, com a radiação absorvida proporcional à concentração do elemento. A excitação eletrônica elementar ocorre em cima da absorção da radiação ultravioleta ou visível em um processo quantized original para cada elemento químico. Em um único processo de elétron, a absorção de um fóton envolve um elétron movendo-se de um nível de energia mais baixo para um nível mais alto dentro do átomo e GF-AAS determina a quantidade de fótons absorvidos pela amostra, que é proporcional ao número de radiação absorvendo elementos atomizados no tubo de grafite.

A seletividade desta técnica depende da estrutura eletrônica dos átomos, em que cada elemento tem uma linha espectral específica de absorção/emissão. No caso do Zn, o comprimento de onda da absorvência é 213,9 nm e pode ser distinguido precisamente de outros metais. No geral, o GF-AAS pode ser utilizado para quantificar o Zn com limites adequados de detecção (LOD) e alta sensibilidade e seletividade²⁵. As mudanças no comprimento de onda absorvido são integradas e apresentadas como picos de absorção de energia em comprimentos de onda específicos e isolados. A concentração do Zn em uma determinada amostra é geralmente calculada a partir de uma curva padrão de concentrações conhecidas de acordo com a lei Beer-Lambert, na qual a absorvência é diretamente proporcional à concentração de Zn na amostra. No entanto, a aplicação da equação de Beer-Lambert às análises de GF-AAS também apresenta algumas complicações. Por exemplo, variações na atomização e/ou concentrações não homogêneas das amostras podem afetar as medições metálicas.

A atomização do metal exigida para a análise elementar do traço do GF AAS consiste em três etapas fundamentais. O primeiro passo é a desolvação, onde o solvente líquido é evaporado; deixando compostos secos após o forno atinge uma temperatura de cerca de 100 ° c. Em seguida, os compostos são vaporizado por aquecendo-os de 800 a 1.400 ° c (dependendo do elemento a ser analisado) e tornar-se um gás. Finalmente, os compostos no estado gasoso são atomizados com temperaturas que variam de 1.500 a 2.500 ° c. Como discutido acima, o aumento das concentrações de um metal de interesse irá render aumentos proporcionais na absorção detectada pelo GF-AAS, mas o forno reduz a gama dinâmica de análise, que é a gama de trabalho de concentrações que podem ser determinado pelo instrumento. Assim, a técnica requer baixas concentrações e uma cuidadosa determinação da amplitude dinâmica do método, determinando o LOD e o limite de linearidade (LOL) da lei Beer-Lambert. O LOD é a quantidade mínima necessária para que uma substância seja detectada, definida como três vezes o desvio padrão de Zn na matriz. O LOL é a concentração máxima que pode ser detectada usando a lei de Beer-Lambert.

Neste trabalho, descrevemos um método padrão para analisar os teores de Zn em extratos celulares inteiros, frações citoplasmáticas e nucleares, e em proliferar e diferenciar células cultivadas (Figura 1). Adaptamos o rápido isolamento do protocolo de núcleos a diferentes sistemas celulares para evitar a perda de metal durante a preparação da amostra. Os modelos celulares utilizados foram mioblasts primários derivados de células de satélite de camundongo, células de neuroblastoma murino (N2A ou Neuro2A), adipócitos murino 3T3 L1, uma linha celular epitelial de mama não tumorigênica humana (MCF10A) e rim canino Madin-Darby epitelial ( MDCK). Estas pilhas foram estabelecidas das linhagens diferentes e são bons modelos para investigar variações específicas da linhagem de níveis do metal in vitro.

Os mioblastos preliminares derivados das pilhas satélites do rato constituem um modelo in vitro well-adequado para investigar a diferenciação do músculo esqueletal. A proliferação destas pilhas é rápida quando cultivada condições elevadas do soro. A diferenciação na linhagem muscular é então induzida por baixas condições do soro³⁰. O neuroblastoma murino (N2A) estabeleceu a linha celular foi derivado da crista neural do rato. Estas pilhas apresentam a morfologia neuronal e amebóide da pilha de haste. Em cima do estímulo da diferenciação, as pilhas N2A apresentam diversas propriedades dos neurônios, tais como neurofilamentos. N2A células são usadas para investigar a doença de Alzheimer, o crescimento do neurite e a neurotoxicidade^31,32,33. Os pré-adipócitos murinos de 3T3-L1 estabelecidos na linhagem celular são comumente utilizados para investigar as alterações metabólicas e fisiológicas associadas à adipogênese. Essas células apresentam uma morfologia fibroblástica, mas uma vez estimuladas para diferenciação, apresentam ativação enzimática associada à síntese lipídica e acúmulo de triglicerídeos. Isso pode ser observado como alterações morfológicas para produzir gotas lipídicas citoplasmáticas^34,35. MCF10A é uma linha celular epithelial mamária do não-tumor derivada de uma mulher na pré-menopausa com doença fibrocística mamária³⁶. Tem sido amplamente utilizado para estudos bioquímicos, moleculares e celulares relacionados à carcinogênese mamária, como proliferação, migração celular e invasão. O rim canino de Madin-Darby (MDCK) linha de pilha epithelial foi usado extensivamente para investigar as propriedades e os eventos moleculars associados com o estabelecimento do phenotype epithelial. Ao chegar à confluência, estas células tornam-se polarizadas e estabelecem aderências de células celulares, características dos tecidos epiteliais de mamíferos³⁷.

Para testar a capacidade de AAS para medir os níveis de Zn em células de mamíferos, analisamos frações inteiras e subcelulares (citosol e núcleo) dessas cinco linhagens celulares. As medidas do AAS mostraram concentrações diferentes de Zn nestes tipos da pilha. As concentrações foram menores em proliferating e diferenciando-se os mioblastos preliminares (4 a 7 nmol/mg da proteína) e mais altamente nas quatro linhas de pilha estabelecidas (que variam de 20 a 40 nmol/magnésio da proteína). Um aumento não-significativo pequeno em níveis de Zn foi detectado em diferenciar mioblastos preliminares e pilhas do neuroblastoma quando comparado às pilhas proliferating. O efeito oposto foi detectado em adipocytes diferenciados. Entretanto, as pilhas 3T3-L1 proliferating exibiram umas concentrações mais elevadas do metal comparadas às pilhas diferenciadas. É importante ressaltar que, nessas três linhagens celulares, o fracionamento subcelular mostrou que o Zn é distribuído diferencialmente no citosol e no núcleo de acordo com o estado metabólico dessas células. Por exemplo, em proliferating mioblasts, células N2A, e 3T3-L1 pré-adipócitos, a maioria do metal é localizada ao núcleo. Em cima da indução da diferenciação usando tratamentos de pilha específicos, Zn localizado ao citosol nestes três tipos da pilha. Curiosamente, ambas as linhagens epiteliais mostraram níveis mais elevados de Zn durante a proliferação quando comparados ao alcance da confluência, em que uma monocamada apertada característica foi formada. Na proliferação de células epiteliais, a linhagem celular mamária MCF10A apresentou igual distribuição de Zn entre o citosol e o núcleo, enquanto na linhagem celular derivada do rim, a maior parte do metal foi localizada no núcleo. Nestes dois tipos da pilha, quando as pilhas alcangaram a confluência, Zn foi ficada situada predominantly ao cytosol. Esses resultados demonstram que a GF-AAS é uma técnica altamente sensível e precisa para a realização de análises elementares em amostras de baixo rendimento. GF-AAS acoplado com fracionamento subcelular e pode ser adaptado para investigar os níveis de oligoelementos metálicos em diferentes linhagens celulares e tecidos.

Protocol

1. cultura de células de mamíferos Considerações gerais Siga as técnicas assépticas para a cultura de células de mamíferos previamente revisadas38. Manter todas as linhas celulares em uma incubadora de 5% CO2 humidificada a 37 ° c. As condições de cultura de célula variam para cada tipo de célula. É importante manter as condições de cultura apropriadas para cada linha celular usada, como variações desses procedimentos lev…

Representative Results

Testou-se a capacidade do GF-AAS em detectar níveis de Zn em células mamíferas (Figura 1). Assim, nós cultivou os mioblastos preliminares derivados das pilhas satélites do rato, e as linhas de pilha estabelecidas N2A (neuroblastoma derivado), 3T3 L1 (adipocytes), MCF10A (epitélio da mama), e pilhas de MDCK (epitélio do rim do cão). Primeiramente, foram isoladas frações de células inteiras, citosónicas e nucleares de todos esses tipos de células e…

Discussion

A espectroscopia de absorvância atômica é um método altamente sensível para quantificação de Zn em amostras biológicas de pequeno volume/massa. A otimização descrita da medição de Zn faz com que a aplicação deste método seja simples e garante condições analíticas ideais. Aqui, utilizando-se GF-AAS, determinou-se a concentração de Zn em células inteiras, e em frações citosónicas e nucleares, de diferentes linhagens celulares. Os resultados mostram que essa técnica se torna comparável àquelas obt…

Materials

3-isobutyl-1-methylxanthine	Sigma Aldrich	I5879
Acetic Acid	Sigma Aldrich	1005706
Anti Brg1-antibody (G7)	Santa Cruz biotechnologies	sc-17796
Anti b-tubulin-antibody (BT7R)	Thermo Scientific	MA5-16308
Bradford	Biorad	5000205
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902
Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM)	ThermoFischer-Gibco	11965092
Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12)	ThermoFischer-Gibco	11320033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	ThermoFischer-Gibco	14190144
Epidemal Growth Factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFischer-Gibco	16000044
Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155)	ThermoFischer-Gibco	PHG0024
Horse serum	ThermoFischer-Gibco	16050122
Hydrocortisone	Sigma Aldrich	H0888
Hydrogen Peroxide (H2O2)	Sigma Aldrich	95321
Insulin	Sigma Aldrich	91077C
Insulin-Transferrin-Selenium-A	ThermoFischer	51300044
Nitric Acid (HNO3)	Sigma Aldrich	438073
Nonidet P-40 (NP-40)	Thermo Scientific	85125
OptiMEM (Reduced Serum Media)	ThermoFischer-Gibco	31985070
Penicillin-Streptomycin	ThermoFischer-Gibco	15140148
PureCol (Collagen)	Advanced BioMatrix	5005
Retionic Acid	Sigma Aldrich	PHR1187
Troglitazone	Sigma Aldrich	648469-M
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFischer-Gibco	25200056
Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3	Perkin Elmer	N9300168
Established Cell Lines
3T3-L1	American Type Culture Collection	CL-173
MCDK	American Type Culture Collection	CCL-34
MCF10A	American Type Culture Collection	CRL-10317
N2A	American Type Culture Collection	CCL-131
Equipment
Atomic Absortion spectrophotometer	PerkinElmer	Aanalyst 800
Bioruptor	Diagnode	UCD-200