Espectroscopía de absorbancia atómica para medir las agrupaciones intracelulares de zinc en células de mamífero
Summary
Las líneas celulares cultivadas primarias o establecidas se utilizan comúnmente para abordar las cuestiones biológicas y mecanicistas fundamentales como un enfoque inicial antes de usar modelos animales. Este protocolo describe cómo preparar extractos celulares enteros y fracciones subcelulares para estudios de zinc (Zn) y otros oligoelementos con espectroscopía de absorbancia atómica.
Abstract
Los metales de transición son micronutrientes esenciales para los organismos, pero pueden ser tóxicos para las células a altas concentraciones al competir con los metales fisiológicos en las proteínas y generar estrés redox. Las afecciones patológicas que conducen a la depleción o acumulación de metales son agentes causales de diferentes enfermedades humanas. Algunos ejemplos incluyen anemia, Acrodermatitis enteropatica, y las enfermedades de Wilson y Menkes. Por lo tanto, es importante poder medir los niveles y el transporte de metales de transición en muestras biológicas con alta sensibilidad y precisión con el fin de facilitar la investigación explorando cómo estos elementos contribuyen a las funciones fisiológicas normales y Toxicidad. El zinc (Zn), por ejemplo, es un cofactor en muchas proteínas de mamíferos, participa en eventos de señalización, y es un mensajero secundario en las células. En exceso, Zn es tóxico y puede inhibir la absorción de otros metales, mientras que en el déficit, puede conducir a una variedad de condiciones potencialmente letales.
La espectroscopía de absorción atómica del horno de grafito (GF-AAS) proporciona un método altamente sensible y eficaz para determinar la concentración de Zn y otras concentraciones de metales de transición en muestras biológicas diversas. La atomización electrotérmica mediante GF-AAS cuantifica los metales mediante la atomización de pequeños volúmenes de muestras para el posterior análisis selectivo de la absorción mediante la longitud de onda de la excitación del elemento de interés. Dentro de los límites de la linealidad de la ley de la cerveza-Lambert, la absorbancia de la luz por el metal es directamente proporcional a la concentración del analito. En comparación con otros métodos de determinación del contenido de Zn, GF-AAS detecta tanto el Zn en las proteínas libres como los complejados y posiblemente en pequeñas moléculas intracelulares con alta sensibilidad en pequeños volúmenes de muestras. Por otra parte, GF-AAS es también más fácilmente accesible que la espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) o fluorescencia de rayos X basada en sincrotrón. En este método, se describe la preparación sistemática de muestras de diferentes líneas celulares cultivadas para análisis en un GF-AAS. Las variaciones en este oligoelemento se compararon tanto en los lisados celulares enteros como en las fracciones subcelulares de células proliferantes y diferenciadas como prueba de principio.
Introduction
La transición y los metales pesados, como Zn, Cu, Mn y fe, se encuentran de forma natural en el medio ambiente, tanto en nutrientes como en alimentos y contaminantes. Todos los organismos vivos requieren diferentes cantidades de estos micronutrientes; sin embargo, la exposición a niveles elevados es perjudicial para los organismos. La adquisición de metal es principalmente a través de la dieta, pero los metales también pueden ser inhalados o absorbidos a través de la piel1,2,3,4,5. Es importante señalar que la presencia de metales en las partículas atmosféricas está aumentando y se ha asociado en gran medida a los riesgos para la salud. Debido a las actividades antropogénicas, se han detectado niveles crecientes de metales pesados como AG, como, CD, CR, Hg, ni, fe y Pb en las partículas atmosféricas, el agua de lluvia y el suelo6,7. Estos metales tienen el potencial de competir con oligoelementos fisiológicos esenciales, particularmente Zn y fe, e inducen efectos tóxicos al inactivar las enzimas fundamentales para los procesos biológicos.
El oligoelemento Zn es redox neutro y se comporta como un ácido Lewis en las reacciones biológicas, lo que lo convierte en un cofactor fundamental necesario para la actividad de plegado y catalítico de proteínas en más del 10% de las proteínas de mamíferos8,9, 10; en consecuencia, es esencial para las diversas funciones fisiológicas8,11. Sin embargo, como muchos oligoelementos, hay un delicado equilibrio entre estos metales facilitando la función fisiológica normal y causando toxicidad. En los mamíferos, las deficiencias de Zn conducen a anemia, retraso del crecimiento, hipogonadismo, anomalías de la piel, diarrea, alopecia, trastornos del gusto, inflamación crónica, y las funciones inmunes y neurológicas deterioradas11,12, 13,14,15,16,17,18. En exceso, el Zn es citotóxico y perjudica la absorción de otros metales esenciales como el cobre19,20,21.
Además, algunos metales como Cu y fe tienen el potencial de participar en reacciones dañinas. La producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) a través de Fenton química puede interferir con el montaje de proteínas de racimo de azufre de hierro y alterar el metabolismo lipídico22,23,24. Para evitar este daño, las células utilizan chaperones de unión metálica y transportadores para prevenir efectos tóxicos. Sin lugar a dudas, la la homeostasis metálica debe controlarse estrechamente para garantizar que los tipos celulares específicos mantengan los niveles adecuados de metales. Por esta razón, hay una necesidad significativa de avanzar técnicas para la medición precisa de trazas de metales en muestras biológicas. En los organismos en desarrollo y maduros existe una necesidad biológica diferencial para oligoelementos a nivel celular, en diferentes etapas de desarrollo, y en condiciones normales y patológicas. Por lo tanto, la determinación precisa de los niveles de tejido y del metal sistémico es necesaria para entender la homeostasis del metal organismal.
La espectrometría de absorción atómica del horno de grafito (GF-AAS) es una técnica altamente sensible utilizada para pequeños volúmenes de muestras, por lo que es ideal para medir la transición y metales pesados presentes en muestras biológicas y medioambientales25,26 , 27 , 28. por otra parte, debido a la alta sensibilidad de la técnica, se ha demostrado que es adecuada para el estudio de las propiedades de transporte fino de na+/k+-ATPasa yH+/k-ATPasa gástrica ovocitos como un sistema modelo29. En GF-AAS, los elementos atomizados dentro de una muestra absorben una longitud de onda de la radiación emitida por una fuente de luz que contiene el metal de interés, con la radiación absorbida proporcional a la concentración del elemento. La excitación electrónica elemental tiene lugar tras la absorción de la radiación ultravioleta o visible en un proceso cuantizado único para cada elemento químico. En un solo proceso de electrones, la absorción de un fotones implica un electrón que se mueve desde un nivel de energía más bajo al nivel más alto dentro del átomo y GF-AAS determina la cantidad de fotómetros absorbidos por la muestra, que es proporcional al número de radiación que absorbe elementos atomizados en el tubo de grafito.
La selectividad de esta técnica se basa en la estructura electrónica de los átomos, en el que cada elemento tiene una línea espectral de absorción/emisión específica. En el caso de Zn, la longitud de onda de absorbancia es de 213,9 NM y se puede distinguir con precisión de otros metales. En general, GF-AAS se puede utilizar para cuantificar Zn con límites adecuados de detección (LOD) y alta sensibilidad y selectividad25. Los cambios en la longitud de onda absorbida se integran y se presentan como picos de absorción de energía en longitudes de onda específicas y aisladas. La concentración del Zn en una muestra determinada se calcula generalmente a partir de una curva estándar de concentraciones conocidas según la ley cerveza-Lambert, en la que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración de Zn en la muestra. Sin embargo, aplicar la ecuación de Beer-Lambert a los análisis de GF-AAS también presenta algunas complicaciones. Por ejemplo, las variaciones en la atomización y/o concentraciones no homogéneas de las muestras pueden afectar las mediciones de metal.
La atomización metálica necesaria para el análisis elemental de trazas GF AAS consta de tres pasos fundamentales. El primer paso es la desolvación, donde se evada el disolvente líquido; dejando compuestos secos después de que el horno alcanza una temperatura de alrededor de 100 ° c. Luego, los compuestos se vaporizan calentándolos de 800 a 1.400 ° c (dependiendo del elemento a analizar) y convertirse en un gas. Finalmente, los compuestos en estado gaseoso se atomizan con temperaturas que oscilan entre 1.500 y 2.500 ° c. Como se discutió anteriormente, el aumento de las concentraciones de un metal de interés representará aumentos proporcionales en la absorción detectada por el GF-AAS, sin embargo, el horno reduce el rango dinámico de análisis, que es el rango de trabajo de las concentraciones que se pueden determinado por el instrumento. Por lo tanto, la técnica requiere bajas concentraciones y una cuidadosa determinación del rango dinámico del método mediante la determinación del LOD y el límite de linealidad (LOL) de la ley Beer-Lambert. El LOD es la cantidad mínima requerida para detectar una sustancia, definida como tres veces la desviación estándar de Zn en la matriz. El LOL es la concentración máxima que se puede detectar utilizando la ley de cerveza-Lambert.
En este trabajo, describimos un método estándar para analizar los niveles de Zn en extractos celulares enteros, fracciones citoplásmicas y nucleares, y en células cultivadas proliferantes y diferenciadoras (figura 1). Adaptamos el rápido aislamiento del Protocolo de núcleos a diferentes sistemas celulares para evitar la pérdida de metal durante la preparación de la muestra. Los modelos celulares utilizados fueron myoblastos primarios derivados de las células del satélite del ratón, células del neuroblastoma murino (N2A o Neuro2A), murino 3T3 L1 adipocitos, una línea de células epiteliales de mama no tumorigénica humana (MCF10A), y el riñón canino de Madin-Darby epitelial ( MDCK). Estas células se establecieron a partir de diferentes linajes y son buenos modelos para investigar variaciones específicas del linaje de los niveles de metal in vitro.
Las mioblastos primarias derivadas de las células satélite del ratón constituyen un modelo in vitro muy adecuado para investigar la diferenciación del músculo esquelético. La proliferación de estas células es rápida cuando se cultiva en condiciones séricas elevadas. La diferenciación en el linaje muscular se induce entonces por las condiciones séricas bajas30. El neuroblastoma murino (N2A) estableció la línea celular se derivó de la cresta neural del ratón. Estas células presentan morfología neuronal y de células madre amoeboides. Al estímulo de diferenciación, las células N2A presentan varias propiedades de las neuronas, como los neurofilamentos. N2A células se utilizan para investigar la enfermedad de Alzheimer, neurita outgrowth, y neurotoxicidad31,32,33. El 3T3-L1 murino pre-adipocitos establecido línea celular se utiliza comúnmente para investigar los cambios metabólicos y fisiológicos asociados con la adipogénesis. Estas células presentan una morfología de fibroblastos, pero una vez estimuladas para la diferenciación, presentan activación enzimática asociada con la síntesis de lípidos y la acumulación de triglicéridos. Esto se puede observar como cambios morfológicos para producir gotas de lípidos citoplásmicos34,35. MCF10A es una línea de células epiteliales mamarias no tumorales derivada de una mujer premenopáusica con enfermedad fibroquística mamaria36. Ha sido ampliamente utilizado para los estudios bioquímicos, moleculares, y celulares relacionados con la carcinogénesis mamaria como la proliferación, migración celular, y la invasión. La línea celular epitelial del riñón de Madin-Darby (MDCK) se ha utilizado extensivamente para investigar las propiedades y los eventos moleculares asociados con el establecimiento del fenotipo epitelial. Al llegar a la confluencia, estas células se polarizan y establecen adherencias de células celulares, características de los tejidos epiteliales de mamíferos37.
Para probar la capacidad de AAS para medir los niveles de Zn en células de mamíferos, analizamos fracciones enteras y subcelulares (citosol y núcleo) de estas cinco líneas celulares. Las mediciones de AAS mostraron diferentes concentraciones de Zn en estos tipos de células. Las concentraciones fueron menores en la proliferación y diferenciación de las mioblastos primarias (4 a 7 nmol/mg de proteína) y superiores en las cuatro líneas celulares establecidas (que oscilan entre 20 y 40 nmol/mg de proteína). Se detectó un pequeño aumento no significativo en los niveles de Zn en la diferenciación de las células mioblastos primarias y del neuroblastoma en comparación con las células proliferantes. El efecto opuesto se detectó en adipocitos diferenciados. Sin embargo, proliferando células 3T3-L1 mostraron concentraciones más altas del metal en comparación con las células diferenciadas. Es importante destacar que, en estas tres líneas celulares, el fraccionamiento subcelular demostró que Zn se distribuye de forma diferencial en el citosol y el núcleo de acuerdo con el estado metabólico de estas células. Por ejemplo, en mioblastos proliferantes, células N2A y preadipocitos 3T3-L1, la mayoría del metal se localiza en el núcleo. Tras la inducción de la diferenciación utilizando tratamientos celulares específicos, Zn localizada en el citosol en estos tres tipos de células. Curiosamente, ambas líneas celulares epiteliales mostraron niveles más altos de Zn durante la proliferación en comparación con al alcanzar la confluencia, en el que se formó una monocapa ajustada característica. En las células epiteliales proliferantes, la línea de células mamarias MCF10A tenía una distribución de Zn igual entre el citosol y el núcleo, mientras que en la línea celular derivada del riñón, la mayor parte del metal se encontraba en el núcleo. En estos dos tipos celulares, cuando las células alcanzaron la confluencia, Zn se encontraba predominantemente en el citosol. Estos resultados demuestran que GF-AAS es una técnica altamente sensible y precisa para realizar análisis elementales en muestras de bajo rendimiento. GF-AAS junto con fraccionamiento subcelular y puede ser adaptado para investigar los niveles de oligoelementos metálicos en diferentes líneas celulares y tejidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La espectroscopía de absorbancia atómica es un método altamente sensible para la cuantificación de Zn en muestras biológicas de volumen pequeño/masa. La optimización descrita de la medición de Zn hace que la aplicación de este método sea simple y garantiza condiciones analíticas ideales. Aquí, utilizando GF-AAS, determinamos la concentración de Zn en células enteras, y en fracciones citosólicas y nucleares, de diferentes líneas celulares. Los resultados demuestran que esta técnica es comparable a la obte…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Premio de académicos de diversidad de la Facultad de la escuela de medicina de la Universidad de Massachusetts a T.P.-B. N.N.-T. es apoyado por SEP-CONACYT, subvención 279879. J. g. N es apoyado por la Fundación Nacional de ciencia Grant DBI 0959476. Los autores están agradecidos al Dr. Daryl a. Bosco por proporcionar la línea celular N2A y a Daniella Cangussu por su apoyo técnico.
Materials
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma Aldrich | I5879 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1005706 | |
| Anti Brg1-antibody (G7) | Santa Cruz biotechnologies | sc-17796 | |
| Anti b-tubulin-antibody (BT7R) | Thermo Scientific | MA5-16308 | |
| Bradford | Biorad | 5000205 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) | ThermoFischer-Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) | ThermoFischer-Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFischer-Gibco | 14190144 | |
| Epidemal Growth Factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer-Gibco | 16000044 | |
| Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) | ThermoFischer-Gibco | PHG0024 | |
| Horse serum | ThermoFischer-Gibco | 16050122 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) | Sigma Aldrich | 95321 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-A | ThermoFischer | 51300044 | |
| Nitric Acid (HNO3) | Sigma Aldrich | 438073 | |
| Nonidet P-40 (NP-40) | Thermo Scientific | 85125 | |
| OptiMEM (Reduced Serum Media) | ThermoFischer-Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFischer-Gibco | 15140148 | |
| PureCol (Collagen) | Advanced BioMatrix | 5005 | |
| Retionic Acid | Sigma Aldrich | PHR1187 | |
| Troglitazone | Sigma Aldrich | 648469-M | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFischer-Gibco | 25200056 | |
| Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 | Perkin Elmer | N9300168 | |
| Established Cell Lines | |||
| 3T3-L1 | American Type Culture Collection | CL-173 | |
| MCDK | American Type Culture Collection | CCL-34 | |
| MCF10A | American Type Culture Collection | CRL-10317 | |
| N2A | American Type Culture Collection | CCL-131 | |
| Equipment | |||
| Atomic Absortion spectrophotometer | PerkinElmer | Aanalyst 800 | |
| Bioruptor | Diagnode | UCD-200 |
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