ヒトの胎児微生物叢に対する介入レジメンの影響を推定するインビトロバッチ培養モデル
Summary
このプロトコルは、ヒトのフェカル微生物叢のインビトロバッチ培養発酵システムを説明し、イヌリン(よく知られているプレバイオティクスと最も広く研究された微生物モジュレーターの1つ)を使用して、特定の効果を推定する上でこのシステムの使用を実証する。fecal微生物叢組成および代謝活動に対する介入。
Abstract
いくつかのヒト疾患における腸内微生物叢の新たな役割は、新しいツール、技術、技術のブレークスルーを必要とします。このような改善は、人間の健康上の利点のためのマイクロバイオームモジュレータの利用を解読するために必要とされます。しかし、マイクロバイオーム変調を検証し、関連する健康上の利点を予測するための変調器の大規模なスクリーニングと最適化は、多数の動物および/またはヒト被験者が必要とするため、実質的に困難な場合があります。この目的のために、インビトロまたはex vivoモデルは、マイクロバイオームモジュレーターの予備スクリーニングを容易にすることができる。本明細物では、プロバイオティクス、プレバイオティクスおよび他の食品成分を含む腸内微生物叢の様々な介入の効果を調べることができるex vivo fecalマイクロビオタ培養システムを最適化し、実証する。栄養補助食品および薬物、ヒト腸内微生物叢の多様性および組成物に関する。最も広く研究されているプレバイオティクス化合物およびマイクロバイオームモジュレーターの1つであるイヌリンは、健康なフェカル微生物叢組成物およびその代謝活性(フェカルpHおよび有機酸のフェカルレベルなど)への影響を調べるために、ここで例として使用される。乳酸および短鎖脂肪酸(SCFA)を含む。このプロトコルは、フェカル微生物叢プロファイルに対するモジュレーターの異なる介入の影響を推定し、その健康への影響を予測することを目的とした研究に役立つ可能性がある。
Introduction
ヒト微生物叢は、細菌、古細菌、ウイルスおよび真核生物微生物1からなる複雑なコミュニティであり、人体の内部および外部に生息する。最近の証拠は、肥満、糖尿病を含む様々なヒト疾患における腸内微生物叢および腸内微生物叢(ヒト消化管に見られる微生物とその遺伝子の全コレクション)の基本的な役割を確立している。心血管疾患、および癌1、2、3.さらに、腸内に生息する微生物は、私たちの健康に大きな影響を与える代謝産物の広いスペクトルを生成し、また、いくつかの疾患の病態生理学だけでなく、様々な代謝機能4に貢献することができます4、5.この腸内微生物集団の組成および機能における異常な変化(摂動)は、一般に「腸ジスビオシス」と呼ばれる。ジスビオシスは、通常、宿主の不健康な状態に関連付けられているので、宿主の健全な制御状態に関連する正常な(恒常性)微生物群相と区別することができる。腸内微生物叢ジスビオシスの特定のパターンは、多くの場合、様々な異なる疾患1、2、3、6、7に見出される。
腸内微生物叢による未消化食品、特に発酵性炭水化物/繊維の発酵は、エネルギーを生み出すだけでなく、短鎖脂肪酸(SCFA)、乳酸塩、受刑者、二酸化炭素を含む発散代謝産物を産生し、メタン、水素、エタノール6.さらに、腸内微生物叢はまた、葉酸、ビオチン、トリメチルアミン-N-酸化物、セロトニン、トリプトファン、γ-アミノブチル酸、ドーパミン、ノルエピネフリン、アセチルコリン、ヒスタミン、などの他の生理活性物質の数を生成します。デオキシコール酸、および4-エチルフェニル硫酸塩。これは主に、いくつかの身体プロセス、代謝機能およびエピジェネティック変化1、8、9に寄与する宿主微生物ニッチ内の固有の代謝フラックスの利用によって起こる。 10.しかし、このような微生物製品に対する様々な介入の影響は、簡単で効率的かつ再現可能なプロトコルの欠如のために、未だ不明のままである。ヒト腸内微生物叢組成物は非常に複雑で多様な生態系であり、したがって、人間の健康と疾患病理学におけるその役割に関する多くの疑問は未だに未解決のままである。腸内微生物叢の組成および代謝機能に対する多くの一般的な腸内微生物叢(例えば、プロバイオティクス、プレバイオティクス、抗生物質、女性移植および感染症)の影響は、大部分が解明されていない。さらに、生体内でのこれらの効果の検査と検証は、特に腸内微生物叢によって産生される栄養素や代謝産物のほとんどが腸内で同時かつ迅速に吸収または処分されるため、困難である。したがって、生体内でこれらの代謝産物(例えば、SCFA)の産生、量および処理を測定することは、依然として実用的な課題である。実際、動物やヒト被験者などの生理学的モデルは、腸内微生物叢の役割と宿主の健康に対する変調を決定するために重要であるが、これらは、異なるタイプのマイクロバイオーム調節剤の大規模なスクリーニングには適していないかもしれない。倫理的、金銭的、または時間的制約。この目的のために、インビトロおよび/またはex vivoモデルでは、インビトロで腸内微生物叢を培養し、異なる微生物叢に介入することで、時間とお金を節約する機会を提供することができ、したがって、予備的または大規模なスクリーニングを可能にすることができます。様々な成分(プロバイオティクス、プレバイオティクス、および他の介入化合物など)は、女性の微生物叢の多様性、組成および代謝プロファイルに及ぼす影響を調べたり予測する。腸内微生物叢のこのようなインビトロおよびex vivo系を用いる研究は、宿主の健康と疾患に寄与する宿主-マイクロバイオーム相互作用のさらなる理解を促進し、また、マイクロバイオームを標的とする新しい治療法を見つけることにもつながる可能性がある。宿主の健康を改善し、様々な疾患を予防し、治療する1.
インビトロ腸内微生物叢培養システムは実際の腸の状態を本当に複製することはできませんが、いくつかの研究室はそのようなモデルの開発に努めており、そのうちのいくつかはある程度実用的に発見され、成功裏に使用されています。異なる目的。最近の腸のモデルの1つは、胃、小腸、結腸の異なる領域を含む人間の消化管全体を模倣するヒト腸微生物生態系のシミュレータである。しかし、このような技術的に複雑なモデルは、世界中の他の研究施設からアクセスできない場合があります。したがって、マイクロバイオームモジュレーターを研究する研究室にとって、比較的シンプルで手頃な価格で実用的な新しい代替モデルの開発と、腸内微生物叢および宿主の健康への影響に対する重要なニーズが依然として存在する。したがって、インビトロ(またはex vivo)フェカル微生物叢培養システムの使用は、そのような介入の効果を研究するのに有用であろう11,12.具体的には、腸内微生物叢の多様性と組成物の周期的変化の観点から、異なるプレバイオティクスが微生物叢発酵能力に及ぼす影響、およびFECAL pH、およびSCFAおよび乳酸塩を含む微生物代謝産物のレベルを研究することができる。13.本明細書において、微生物叢調節剤の一例としてイヌリン(最も広く研究されたプレバイオティック成分の1つ)を用いて、この単純な生体生微生物叢バッチ培養系のステップバイステッププロトコルは、その使用を実証するために記載されている。微生物叢への介入後の女性微生物叢および微生物代謝産物の変化。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで提示されるインビトロフェカルスラリー発酵モデルは、ヒトの大腿骨微生物叢の組成に対する異なる基質および微生物株(例えば、プレバイオティクスおよびプロバイオティクス)の影響を近似する単純な単一バッチモデルである。fecal pH および SCFA レベルの面で代謝活動.本明細に提示された結果は、イヌリンの接種がfecal pHを減少させ、非処理されたフェカル微生物叢培養と比較して?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、糖尿病、肥満と代謝のためのセンターと臨床翻訳科学センター、ウェイクフォレスト医学部、国防総省の資金援助(助成番号:W81XWH-18-1-0118)からの資金援助を感謝します。カーミットグレンフィリップスII心臓血管医学の椅子;国立衛生研究所は、クロードD.ペッパー古いアメリカ人センター(P30AG12232によって資金提供)に資金を提供しました。R01AG18915;R01DK114224および臨床翻訳科学センター(臨床研究ユニット、UL1TR001420によって資金提供)はまた、ありがたいことに認められている。また、この実験中に、ボランティアの方々と他のラボメンバーの技術支援に感謝します。
Materials
| Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
| Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
| DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
| Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
| Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
| Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
| Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
| Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
| N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
| P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
| Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
| Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
| Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
| Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
| Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| 0.22 µm membrane filter | |||
| AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
| Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
| Bottle filter | Corning | ||
| Cheesecloth | |||
| Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
| pH meter | |||
| Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
| Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
| Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
| Vortex | Thermoscientific | ||
| Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |
Riferimenti
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