نموذج في المختبر دفعة الثقافة لتقدير آثار النظم التدخلية على ميكروبيوتا البراز البشري
Summary
يصف هذا البروتوكول نظام تخمير في المختبر للزراعة الدفعية من ميكروبيوتا البراز البشري، وذلك باستخدام الإينولين (البريبايوتيك المعروف واحد من أكثر المغيرات المجهرية دراسة على نطاق واسع) لإثبات استخدام هذا النظام في تقدير آثار محددة التدخلات على تكوين ميكروبيوتا البراز والأنشطة الأيضية.
Abstract
الدور الناشئ للميكروبيوم الأمعاء في العديد من الأمراض البشرية يتطلب اختراقا من الأدوات والتقنيات والتكنولوجيات الجديدة. وثمة حاجة إلى هذه التحسينات لفك رموز استخدام المغيرات الميكروبيوم لفوائد صحة الإنسان. ومع ذلك، فإن الفحص الواسع النطاق والتحسين الأمثل للمعدّات للتحقق من تعديل الميكروبيوم والتنبؤ بالفوائد الصحية ذات الصلة قد يكون صعباً من الناحية العملية بسبب الحاجة إلى عدد كبير من الحيوانات و/أو البشر. ولهذا الغرض، يمكن لنماذج الجسم الحي في المختبر أو في الجسم الحي السابق أن تيسر الفحص الأولي لمغيرات الميكروبيوم. هنا, هو الأمثل وثبت نظام ثقافة ميكروبيوتا البراز السابقين التي يمكن استخدامها لدراسة آثار التدخلات المختلفة من المغيرين ميكروبيوم الأمعاء بما في ذلك البروبيوتيك, البريبايوتكس وغيرها من المكونات الغذائية, وبصرف النظر عن المغذيات والمخدرات، على تنوع وتكوين ميكروبيوتا الأمعاء البشرية. يستخدم الإينولين، وهو واحد من المركبات البريبايوتيك الأكثر دراسة على نطاق واسع وأجهزة التحويرات الميكروبيوم، كمثال هنا لدراسة تأثيره على تكوين ميكروبيوتا البراز الصحي وأنشطته الأيضية، مثل درجة الحموضة البرازية ومستويات البراز من الأحماض العضوية بما في ذلك اللاكتات والأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs). وقد يكون البروتوكول مفيداً للدراسات الرامية إلى تقدير آثار التدخلات المختلفة للمعوّلين على ملامح الكائنات المجهرية البرازية والتنبؤ بآثارها الصحية.
Introduction
الكائنات الحية الدقيقة البشرية هي مجتمع معقد يتكون من البكتيريا والآثار والفيروسات والميكروبات eukaryotic1، التي تسكن جسم الإنسان داخليا وخارجيا. وقد أثبتت الأدلة الحديثة الدور الأساسي لميكروبيوتا الأمعاء وميكروبيوم الأمعاء (مجموعة كاملة من الميكروبات وجيناتها الموجودة في الجهاز الهضمي البشري) في مختلف الأمراض البشرية بما في ذلك السمنة والسكري، أمراض القلب والأوعية الدموية، والسرطان1،2،3. بالإضافة إلى ذلك، الكائنات الحية الدقيقة التي تعيش في الأمعاء لدينا تنتج مجموعة واسعة من الأيض التي تؤثر بشكل كبير على صحتنا ويمكن أن تسهم أيضا في الفيزيولوجيا المرضية للعديد من الأمراض، فضلا عن مجموعة متنوعة من الوظائف الأيضية4، 5.التغيرات غير الطبيعية (الاضطرابات) في تكوين ووظيفة هذه المجموعة الميكروبية الأمعاء وتسمى عموما باسم “dysbiosis الأمعاء”. عادة ما يرتبط Dysbiosis مع حالة غير صحية من المضيف، وبالتالي يمكن تمييزها عن المجتمع الميكروبي العادي (المثلية) المرتبطة بحالة السيطرة الصحية للمضيف. أنماط محددة من خلل biosbiosis ميكروبيوم الأمعاء غالبا ما توجد في مختلف الأمراض المختلفة1،2،3،6،7.
تخمير المواد الغذائية غير المهضومة، ولا سيما الكربوهيدرات القابلة للتخمير / الألياف، من قبل ميكروبيوتا الأمعاء ليس فقط تنتج الطاقة ولكن أيضا تنتج الأيض متباينة بما في ذلك الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs)، اللاكتات، فورمات، ثاني أكسيد الكربون، الميثان والهيدروجين والإيثانول6. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ميكروبيوتا الأمعاء تنتج أيضا عددا من المواد النشطة بيولوجيا أخرى مثل الفولات، البيوتين، تريميثيلامين-Nأكسيد، السيروتونين، التربتوفان، حمض غاما أمينوبوتيريك، الدوبامين، بافراز، أستيل، الهستامين، حمض الديوكسيكوليك، وكبريتات الإيثيل فينيل 4. يحدث هذا في المقام الأول من خلال استخدام التدفقات الأيضية الجوهرية داخل محراب الميكروب المضيف، والذي يساهم في العديد من عمليات الجسم، وظائف التمثيل الغذائي والتغيرات الجينيّة1،8،9، 10. ومع ذلك، فإن آثار مختلف التدخلات على هذه المنتجات الميكروبية لا تزال غير واضحة أو غير واضحة بسبب عدم وجود بروتوكولات سهلة وفعالة ويمكن استنساخها. تكوين ميكروبيوتا الأمعاء البشرية هو نظام بيئي معقد للغاية ومتنوعة، وبالتالي، فإن العديد من الأسئلة حول دورها في صحة الإنسان وأمراض الأمراض لا تزال دون إجابة. آثار العديد من المغيرات ميكروبيوم الأمعاء الشائعة (على سبيل المثال، البروبيوتيك، البريبايوتكس، المضادات الحيوية، زرع البراز والالتهابات) على تكوين وظائف التمثيل الغذائي للميكروبيوتا المعوية لا تزال بعيدة المنال إلى حد كبير. وبالإضافة إلى ذلك، فإن فحص هذه الآثار والتحقق منها في الجسم الحي أمر صعب، لا سيما لأن معظم العناصر الغذائية والأيض التي تنتجها ميكروبيوتا الأمعاء يتم امتصاصها أو التخلص منها في وقت واحد وبسرعة في الأمعاء. ولذلك، فإن قياس إنتاج وكمية ومعالجة هذه الأيض (على سبيل المثال، SCFAs) في الجسم الحي لا يزال يشكل تحديا ً عملياً. في الواقع، النماذج الفسيولوجية مثل الحيوانات والمواضيع البشرية حاسمة لتحديد دور ميكروبيوم الأمعاء وتعديلها على صحة المضيف، ولكن هذه قد لا تكون مناسبة لفحص على نطاق واسع لأنواع مختلفة من المغيرات ميكروبيوم بسبب القيود الأخلاقية أو النقدية أو الزمنية. ولهذا الغرض، يمكن أن توفر نماذج في المختبر و/أو الجسم الحي السابق، مثل زراعة الكائنات المجهرية في المختبر ومن ثم التدخل مع مغيرات الميكروبيوتا المختلفة، فرصاً لتوفير الوقت والمال، وبالتالي يمكن أن تسمح بالفحص الأولي أو الواسع النطاق مكونات مختلفة (مثل البروبيوتيك, البريبايوتكس, وغيرها من المركبات التدخلية) لدراسة / التنبؤ بآثارها على تنوع ميكروبيوتا البراز, تكوين وملامح التمثيل الغذائي. وقد تسهل الدراسات التي تستخدم هذه النظم المختبرية والذاتية للميكروبيوم الأمعاء ية المزيد من الفهم للتفاعلات بين المضيف والميكروبيوم التي تسهم في استضافة الصحة والمرض، ويمكن أن تؤدي أيضا إلى إيجاد علاجات جديدة تستهدف الميكروبيوم إلى تحسين صحة المضيف والوقاية من الأمراض المختلفة وعلاجها1.
على الرغم من أن أنظمة زراعة ميكروبيوتا الأمعاء في المختبر لا يمكن تكرار حقا الظروف المعوية الفعلية، وقد سعت عدة مختبرات لتطوير مثل هذه النماذج، وقد تم العثور على بعض منها عمليا إلى حد ما، وقد استخدمت بنجاح ل أغراض مختلفة. واحدة من نماذج الأمعاء الأخيرة هو محاكاة النظام الإيكولوجي الميكروبي المعوي البشري، الذي يحاكي الجهاز الهضمي البشري بأكمله، بما في ذلك المعدة والأمعاء الدقيقة، ومناطق مختلفة من القولون. غير أن هذه النماذج المعقدة تقنيا قد لا تكون متاحة لمرافق البحوث الأخرى في جميع أنحاء العالم. ولذلك، لا تزال هناك حاجة ماسة لتطوير نماذج بديلة جديدة بسيطة نسبيا وبأسعار معقولة وعملية للمختبرات التي تدرس المغيرات ميكروبيوم وآثارها على ميكروبيوتا الأمعاء وصحة المضيف. وبالتالي، فإن استخدام في المختبر (أو فيالجسم الحي) نظام زراعة ميكروبيوتا البراز سيكون مفيدا لدراسة آثار مثل هذه التدخلات11،12. وعلى وجه التحديد، يمكن دراسة تأثير البريبايوتكس المختلفة على قدرة التخمير الميكروبيوتا من حيث التغيرات الدورية في تنوع الأمعاء المجهرية وتكوينها، ودرجة الحموضة البرازية، ومستويات الأيض الميكروبي بما في ذلك SCFAs واللاكتات 13.هنا، باستخدام الإينولين (واحدة من المكونات البريبايوتيك الأكثر دراسة على نطاق واسع) كمثال على المغير ميكروبيوم، يتم وصف بروتوكول خطوة بخطوة من هذا النظام بسيطة ex فيفو ميكروبيوتا دفعة الثقافة لإثبات استخدامه لتقدير التغيرات في ميكروبيوتا البراز والأيض الميكروبية بعد التدخل مع المغيرات ميكروبيوم.
Protocol
Representative Results
Discussion
نموذج تخمير الطين البراز في المختبر المعروض هنا هو نموذج بسيط من دفعة واحدة لتقريب آثار ركائز مختلفة وسلالات الميكروبية (على سبيل المثال، البريبايوتكس والبروبيوتيك) على تكوين ميكروبيوتا البراز البشري وكذلك الأنشطة الأيضية من حيث مستويات الحموضة البرازية وSCFAs. وتبين النتائج المعروضة هنا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وينوه المؤلفون بامتنان بالدعم التمويلي المقدم من مركز السكري والسمنة والتمثيل الغذائي ومركز العلوم السريرية والترجمة، وكلية ويك فورست للطب، وتمويل وزارة الدفاع (رقم المنحة: W81XWH-18-1-0118)، كيرميت غلين فيليبس الثاني كرسي في طب القلب والأوعية الدموية; ومولت المعاهد الوطنية للصحة مركز كلود د. بيبر لكبار السن الأمريكيين (بتمويل من P30AG12232)؛ R01AG18915; R01DK114224 ومركز العلوم السريرية والترجمة (وحدة البحوث السريرية، بتمويل من UL1TR001420)، هو أيضا لحسن الحظ المعترف بها. كما نشكر المتطوعين على تقديم عينات البراز، وأعضاء المختبر الآخرين على ما يقدمونه من مساعدة تقنية خلال هذه التجربة.
Materials
| Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
| Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
| DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
| Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
| Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
| Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
| Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
| Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
| N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
| P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
| Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
| Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
| Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
| Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
| Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| 0.22 µm membrane filter | |||
| AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
| Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
| Bottle filter | Corning | ||
| Cheesecloth | |||
| Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
| pH meter | |||
| Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
| Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
| Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
| Vortex | Thermoscientific | ||
| Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |
Riferimenti
- Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
- Xu, Z., Knight, R. Dietary effects on human gut microbiome diversity. British Journal of Nutrition. 113, 1-5 (2015).
- Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The gut microbiota and Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimers Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
- Clemente, J. C., Ursell, L. K., Parfrey, L. W., Knight, R. The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view. The Journal Cell. 148 (6), 1258-1270 (2012).
- Yadav, H., Jain, S., Marotta, F. Probiotics mediated modulation of gut flora might be biotherapeutical approach obesity and type 2 diabetes. Metabolomics : Open Access. 1 (3), 1-3 (2011).
- Ahmadi, S., et al. Dietary Polysaccharides in the Amelioration of Gut Microbiome Dysbiosis and Metabolic Diseases. Obesity and Control Theries: Open Access. 4 (3), (2017).
- Nagpal, R., et al. Obesity-Linked Gut Microbiome Dysbiosis Associated with Derangements in Gut Permeability and Intestinal Cellular Homeostasis Independent of Diet. Journal of Diabetes Research. , 1-9 (2018).
- Paul, B., et al. Influences of diet and the gut microbiome on epigenetic modulation in cancer and other diseases. Journal of Clinical Epigenetics. 7 (1), 112 (2015).
- O’mahony, S., Clarke, G., Borre, Y., Dinan, T., Cryan, J. Serotonin tryptophan metabolism and the brain-gut-microbiome axis. Journal of Behavioural Brain Research. 277, 32-48 (2015).
- Sharon, G., et al. Specialized metabolites from the microbiome in health and disease. Journal of Cell Metabolism. 20 (5), 719-730 (2014).
- Faber, T. A., Bauer, L. L., Price, N. P., Hopkins, A. C., Fahey, G. C. In vitro digestion and fermentation characteristics of temulose molasses, a coproduct of fiberboard production, and select temulose fractions using canine fecal inoculum. Journal of Agricultural Food Chemistry. 59 (5), 1847-1853 (2011).
- Bourquin, L. D., Titgemeyer, E. C., Fahey, G. C. Vegetable fiber fermentation by human fecal bacteria: cell wall polysaccharide disappearance and short-chain fatty acid production during in vitro fermentation and water-holding capacity of unfermented residues. Journal of Nutrition. 123 (5), 860-869 (1993).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short-chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Nagpal, R., et al. Comparative microbiome signatures and short-chain fatty acids in mouse, rat, non-human primate and human feces. Frontiers in Microbiology. 9, 2897 (2018).
- Thangamani, S., Guinan, J., Wang, S., Yadav, H. Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids promote gastrointestinal colonization of Candida albicans. bioRxiv. , 428474 (2018).
- Ahmadi, S., et al. Prebiotics from acorn and sago prevent high-fat diet-induced insulin resistance via microbiome-gut-brain axis modulation. The Journal of Nutritional Biochemistry. , (2019).
- Nagpal, R., et al. Gut Microbiome Composition in Non-human Primates Consuming a Western or Mediterranean Diet. Frontiers in Nutrition. 5, 28 (2018).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Garcia-Villalba, R., et al. Alternative method for gas chromatography-mass spectrometry analysis of short-chain fatty acids in faecal samples. Journal of Seperation Science. 35 (15), 1906-1913 (2012).
- Lee, C. H., et al. Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).
- Chen, M. -. H., et al. In vitro fermentation of xylooligosaccharides produced from Miscanthus× giganteus by human fecal microbiota. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64 (1), 262-267 (2015).
- Cook, S., Sellin, J. Short chain fatty acids in health and disease. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 12 (6), 499-507 (1998).
- Rastelli, M., Knauf, C., Cani, P. D. Gut microbes and health: a focus on the mechanisms linking microbes, obesity, and related disorders. Obesity. 26 (5), 792-800 (2018).
- Zou, J., et al. Fiber-mediated nourishment of gut microbiota protects against diet-induced obesity by restoring IL-22-mediated colonic health. Cell Host & Microbe. 23 (1), 41-53 (2018).
- Dinan, T. G., Cryan, J. F. Gut–brain axis in 2016: Brain–gut–microbiota axis—mood, metabolism and behaviour. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 69 (2017).
