Модель In Vitro Batch-culture для оценки влияния интервенционных режимов на человеческую фекальную микробиоту
Summary
Этот протокол описывает систему брожения в партии в пробирке фекальной микробиоты человека, используя инулин (известный пребиотик и один из наиболее широко изученных модуляторов микробиоты), чтобы продемонстрировать использование этой системы в оценке эффектов конкретных вмешательства по составу фекальной микробиоты и метаболической деятельности.
Abstract
Появление микрофлоры кишечника в ряде заболеваний человека требует прорыва новых инструментов, методов и технологий. Такие усовершенствования необходимы для расшифровки использования модуляторов микробиома для пользы для здоровья человека. Однако крупномасштабный скрининг и оптимизация модуляторов для проверки модуляции микробиома и прогнозирования связанных с этим преимуществ для здоровья может быть практически затруднена из-за необходимости большого числа животных и/или людей. С этой целью модели in vitro или ex vivo могут способствовать предварительному скринингу модуляторов микробиома. При этом, он оптимизирован и продемонстрирован ex vivo фекальные микробиоты культуры системы, которые могут быть использованы для изучения последствий различных мероприятий кишечного микробиома модуляторов, включая пробиотики, пребиотики и другие пищевые ингредиенты, в стороне от нутрицевтики и препараты, о разнообразии и составе микрофлоры кишечника человека. Инулин, один из наиболее широко изученных пребиотических соединений и модуляторов микробиома, используется в качестве примера здесь, чтобы изучить его влияние на здоровый состав фекальной микробиоты и его метаболической деятельности, таких как фекальные рН и фекальные уровни органических кислот включая лактат и короткоцепочечные жирные кислоты (СКФО). Протокол может быть полезен для исследований, направленных на оценку воздействия различных вмешательств модуляторов на профили фекальных микробиот и прогнозирование их воздействия на здоровье.
Introduction
Микробиота человека представляет собой сложное сообщество, состоящее из бактерий, археев, вирусов и эукариотических микробов1, которые населяют человеческое тело внутри и снаружи. Недавние данные установили фундаментальную роль кишечной микробиоты и микрофлоры кишечника (вся коллекция микробов и их генов, найденных в желудочно-кишечном тракте человека) в различных заболеваниях человека, включая ожирение, диабет, сердечно-сосудистых заболеваний, и рак1,2,3. Кроме того, микроорганизмы, живущие в нашем кишечнике производят широкий спектр метаболитов, которые существенно влияют на наше здоровье, а также может способствовать патофизиологии нескольких заболеваний, а также различные метаболические функции4, 5. Аномальные изменения (возмущения) в составе и функции этой кишечной микробной популяции обычно называют “кишка дисбиоз”. Дисбиоз обычно ассоциируется с нездоровым состоянием хозяина и, следовательно, может быть дифференцирован от нормального (гомеостатического) микробного сообщества, связанного со здоровым состоянием контроля хозяина. Специфические модели дисбиоза микрофлоры кишечника часто встречаютсяпри различных заболеваниях 1,2,3,6,7.
Брожение непереваренной пищи, особенно ферментируемых углеводов/волокон, кишечной микробиотой не только дает энергию, но и производит различные метаболиты, включая короткоцепочечные жирные кислоты (СКФА), лактат, кормуковый, углекислый газ, метана, водорода и этанола6. Кроме того, кишечная микробиота также производит ряд других биологически активных веществ, таких как фолат, биотин, триметиламин- N-оксид, серотонин, триптофан, гамма-аминобутирная кислота, допамин, норадреналин, ацетилхолин, гистамин, дезоксихоловая кислота и 4-этилфенилов сульфат. Это происходит в первую очередь за счет использования внутренних метаболических флюсов в нише хозяина-микроба,которая способствует нескольким процессам тела, метаболическим функциям и эпигенетическим изменениям 1,8,9, 10. Однако воздействие различных вмешательств на такие микробные продукты остается незаметным или неясным из-за отсутствия простых, эффективных и воспроизводимых протоколов. Состав микробиоты кишечника человека является чрезвычайно сложной и разнообразной экосистемой, и поэтому многие вопросы о его роли в здоровье человека и патологии болезней по-прежнему остаются без ответа. Влияние многих распространенных модуляторов микробиома кишечника (например, пробиотиков, пребиотиков, антибиотиков, фекальной трансплантации и инфекций) на состав и метаболические функции кишечной микробиоты остаются в значительной степени неуловимыми. Кроме того, изучение и проверка этих эффектов in vivo затруднена, особенно потому, что большинство питательных веществ и метаболитов, вырабатываемых микрофлорой кишечника, поглощаются или удаляются одновременно и быстро в кишечнике; поэтому измерение производства, количества и переработки этих метаболитов (например, SCFA) in vivo по-прежнему остается практическим вызовом. Действительно, физиологические модели, такие как животные и человеческие субъекты имеют решающее значение для определения роли микрофлоры кишечника и его модуляции на здоровье хозяина, но они не могут быть пригодны для крупномасштабного скрининга различных типов модуляторов микробиома из-за этические, денежные или временные ограничения. С этой целью, in vitro и/или ex vivo модели, такие как культивирование кишечной микробиоты in vitro, а затем вмешательство с различными модуляторами микробиоты, могут предложить возможности экономии времени и денег и, следовательно, могут позволить предварительный или крупномасштабный скрининг различные компоненты (такие как пробиотики, пребиотики и другие интервенционные соединения) для изучения/прогнозирования их воздействия на разнообразие фекальной микробиоты, состав и метаболические профили. Исследования с использованием таких in vitro и ex vivo систем микрофлоры кишечника могут способствовать дальнейшему пониманию взаимодействий хозяина-микробиома, которые способствуют здоровью и болезням хозяина, а также могут привести к поиску новых методов лечения, нацеленных на микробиом улучшить здоровье хозяина и профилактики илечения различных заболеваний 1.
Хотя системы культуры микрофлоры кишечника in vitro не могут по-настоящему воспроизвести фактические кишечные условия, несколько лабораторий пытались разработать такие модели, некоторые из которых были признаны практически осуществимыми в некоторой степени и успешно использовались для различных целей. Одной из последних моделей кишечника является симулятор кишечной микробной экосистемы человека, который имитирует весь желудочно-кишечный тракт человека, включая желудок, тонкий кишечник и различные области толстой кишки. Однако такие технически сложные модели могут быть недоступны для других научно-исследовательских учреждений во всем мире. Поэтому по-прежнему существует острая необходимость в разработке новых альтернативных моделей, которые являются относительно простыми, доступными и практичными для лабораторий, изучающих модуляторы микробиома и их воздействие на микрофлору кишечника и здоровье хозяев. Таким образом, использование in vitro (или ex vivo) фекальной системы культуры микробиоты было бы полезно для изучения последствий таких мероприятий11,12. В частности, влияние различных пребиотиков на способность брожения микробиоты с точки зрения периодических изменений в разнообразии и составе микрофлоры кишечника, фекальных рН, а также уровни микробных метаболитов, включая СКФА и лактат, могут быть изучены 13. В этом случае, используя инулин (один из наиболее широко изученных пребиотических компонентов) в качестве примера модулятора микробиома, пошаговым протоколом этой простой системы пакетной культуры ex vivo microbiota описан, чтобы продемонстрировать его использование для оценки изменения в фекальной микробиоты и микробных метаболитов после вмешательства с модуляторами микробиома.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленная здесь модель брожения фекальных ферментаций в пробирке является простой односерийной моделью, чтобы приблизить воздействие различных субстратов и микробных штаммов (например, пребиотиков и пробиотиков) на состав фекальной микробиоты человека, а также ее метаболическ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы с благодарностью признают финансовую поддержку со стороны Центра по диабету, ожирению и метаболизму и клинического и трансляционного научного центра, Школы медицины Уэйк-Форест, Министерства обороны (Грант номер: W81XWH-18-1-0118), Кермит Гленн Филлипс II Кафедра сердечно-сосудистой медицины; Национальные институты здравоохранения финансировали Центр пожилых американцев Клода Д. Пеппера (финансируется P30AG122232); R01AG18915; R01DK114224 и Клинический и трансляционный научный центр (Клинический научно-исследовательский отдел, финансируемый UL1TR001420), также с благодарностью признаны. Мы также благодарим добровольцев за предоставление фекальных образцов, и других наших членов лаборатории за их техническую помощь в ходе этого эксперимента.
Materials
| Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
| Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
| DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
| Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
| Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
| Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
| Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
| Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
| N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
| P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
| Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
| Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
| Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
| Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
| Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| 0.22 µm membrane filter | |||
| AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
| Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
| Bottle filter | Corning | ||
| Cheesecloth | |||
| Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
| pH meter | |||
| Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
| Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
| Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
| Vortex | Thermoscientific | ||
| Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |
Riferimenti
- Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
- Xu, Z., Knight, R. Dietary effects on human gut microbiome diversity. British Journal of Nutrition. 113, 1-5 (2015).
- Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The gut microbiota and Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimers Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
- Clemente, J. C., Ursell, L. K., Parfrey, L. W., Knight, R. The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view. The Journal Cell. 148 (6), 1258-1270 (2012).
- Yadav, H., Jain, S., Marotta, F. Probiotics mediated modulation of gut flora might be biotherapeutical approach obesity and type 2 diabetes. Metabolomics : Open Access. 1 (3), 1-3 (2011).
- Ahmadi, S., et al. Dietary Polysaccharides in the Amelioration of Gut Microbiome Dysbiosis and Metabolic Diseases. Obesity and Control Theries: Open Access. 4 (3), (2017).
- Nagpal, R., et al. Obesity-Linked Gut Microbiome Dysbiosis Associated with Derangements in Gut Permeability and Intestinal Cellular Homeostasis Independent of Diet. Journal of Diabetes Research. , 1-9 (2018).
- Paul, B., et al. Influences of diet and the gut microbiome on epigenetic modulation in cancer and other diseases. Journal of Clinical Epigenetics. 7 (1), 112 (2015).
- O’mahony, S., Clarke, G., Borre, Y., Dinan, T., Cryan, J. Serotonin tryptophan metabolism and the brain-gut-microbiome axis. Journal of Behavioural Brain Research. 277, 32-48 (2015).
- Sharon, G., et al. Specialized metabolites from the microbiome in health and disease. Journal of Cell Metabolism. 20 (5), 719-730 (2014).
- Faber, T. A., Bauer, L. L., Price, N. P., Hopkins, A. C., Fahey, G. C. In vitro digestion and fermentation characteristics of temulose molasses, a coproduct of fiberboard production, and select temulose fractions using canine fecal inoculum. Journal of Agricultural Food Chemistry. 59 (5), 1847-1853 (2011).
- Bourquin, L. D., Titgemeyer, E. C., Fahey, G. C. Vegetable fiber fermentation by human fecal bacteria: cell wall polysaccharide disappearance and short-chain fatty acid production during in vitro fermentation and water-holding capacity of unfermented residues. Journal of Nutrition. 123 (5), 860-869 (1993).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short-chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Nagpal, R., et al. Comparative microbiome signatures and short-chain fatty acids in mouse, rat, non-human primate and human feces. Frontiers in Microbiology. 9, 2897 (2018).
- Thangamani, S., Guinan, J., Wang, S., Yadav, H. Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids promote gastrointestinal colonization of Candida albicans. bioRxiv. , 428474 (2018).
- Ahmadi, S., et al. Prebiotics from acorn and sago prevent high-fat diet-induced insulin resistance via microbiome-gut-brain axis modulation. The Journal of Nutritional Biochemistry. , (2019).
- Nagpal, R., et al. Gut Microbiome Composition in Non-human Primates Consuming a Western or Mediterranean Diet. Frontiers in Nutrition. 5, 28 (2018).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Garcia-Villalba, R., et al. Alternative method for gas chromatography-mass spectrometry analysis of short-chain fatty acids in faecal samples. Journal of Seperation Science. 35 (15), 1906-1913 (2012).
- Lee, C. H., et al. Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).
- Chen, M. -. H., et al. In vitro fermentation of xylooligosaccharides produced from Miscanthus× giganteus by human fecal microbiota. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64 (1), 262-267 (2015).
- Cook, S., Sellin, J. Short chain fatty acids in health and disease. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 12 (6), 499-507 (1998).
- Rastelli, M., Knauf, C., Cani, P. D. Gut microbes and health: a focus on the mechanisms linking microbes, obesity, and related disorders. Obesity. 26 (5), 792-800 (2018).
- Zou, J., et al. Fiber-mediated nourishment of gut microbiota protects against diet-induced obesity by restoring IL-22-mediated colonic health. Cell Host & Microbe. 23 (1), 41-53 (2018).
- Dinan, T. G., Cryan, J. F. Gut–brain axis in 2016: Brain–gut–microbiota axis—mood, metabolism and behaviour. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 69 (2017).
