Um modelo de cultura em lote in vitro para estimar os efeitos dos regimes intervencionistas na microbiota fecal humana
Summary
Este protocolo descreve um sistema de fermentação em lote-cultura in vitro de microbiota fecal humana, utilizando inulina (um prebiótico bem conhecido e um dos moduladores de microbiota mais amplamente estudados) para demonstrar o uso deste sistema na estimativa de efeitos de intervenções sobre a composição da microbiota fecal e atividades metabólicas.
Abstract
O papel emergente do microbioma intestinal em várias doenças humanas exige um avanço de novas ferramentas, técnicas e tecnologias. Tais melhorias são necessárias para decifrar a utilização de moduladores de microbioma para benefícios de saúde humana. No entanto, a triagem de grande escala e a otimização de moduladores para validar a modulação de microbioma e prever benefícios de saúde relacionados podem ser praticamente difíceis devido à necessidade de grande número de animais e/ou indivíduos humanos. Para este fim, os modelos in vitro ou ex vivo podem facilitar a triagem preliminar de moduladores de microbioma. Nisto, é otimizado e demonstrou um sistema de cultura de microbiota fecal ex vivo que pode ser usado para examinar os efeitos de várias intervenções de moduladores de microbioma intestinal, incluindo probióticos, prebióticos e outros ingredientes alimentares, além de nutracêuticos e drogas, sobre a diversidade e composição da microbiota intestinal humana. A inulina, um dos compostos prebióticos mais estudados e moduladores de microbioma, é utilizada como exemplo aqui para examinar seu efeito sobre a composição saudável da microbiota fecal e suas atividades metabólicas, como o pH fecal e os níveis fecais de ácidos orgânicos incluindo lactato e ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs). O protocolo pode ser útil para estudos que visem estimar os efeitos de diferentes intervenções de moduladores nos perfis de microbiota fecal e prever seus impactos na saúde.
Introduction
A microbiota humana é uma comunidade complexa constituída por bactérias, archaea, vírus e micróbios eucarióticos1, que habitam o corpo humano internamente e externamente. Evidências recentes estabeleceram o papel fundamental da microbiota intestinal e do microbioma intestinal (toda a coleção de micróbios e seus genes encontrados no trato gastrointestinal humano) em várias doenças humanas, incluindo obesidade, diabetes, doenças cardiovasculares e câncer1,2,3. Além disso, os microrganismos que vivem em nosso intestino produzem um amplo espectro de metabólitos que afetam significativamente a nossa saúde e também podem contribuir para a fisiopatologia de várias doenças, bem como uma variedade de funções metabólicas4, as mudanças 5. anormais (perturbações) na composição e na função desta população microbiana do intestino são denominadas geralmente como o “dysbiosis do intestino”. Dysbiosis é associado geralmente com um estado insalubre do anfitrião e daqui pode ser diferenciado da comunidade microbiana (Homeostatic) normal associada com um estado saudável do controle do anfitrião. Padrões específicos de disbiose do microbioma intestinal são freqüentemente encontrados em várias doenças diferentes1,2,3,6,7.
A fermentação de alimentos não digeridos, particularmente os carboidratos/fibras fermentáveis, pela microbiota intestinal não só produz energia, mas também produz metabólitos divergentes, incluindo ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs), lactato, formate, dióxido de carbono, metano, hidrogênio e etanol6. Além disso, a microbiota intestinal também produz uma série de outras substâncias bioativas, tais como folato, biotina, trimetilamina-N-óxido, serotonina, triptofano, ácido gama-aminobutírico, dopamina, norepinefrina, acetilcolina, histamina, ácido desoxicólico e sulfato de 4-etilfenil. Isso ocorre principalmente através da utilização de fluxos metabólicos intrínsecos dentro do nicho hospedeiro-micróbe, que contribui em vários processos corporais, funções metabólicas e alterações epigenéticas1,8,9, a 10. No entanto, os efeitos de várias intervenções em tais produtos microbianos permanecem não kown ou incerto devido à falta de protocolos fáceis, eficientes e reprodutíveis. A composição da microbiota do intestino humano é um ecossistema extremamente complexo e diversificado, e, portanto, muitas perguntas sobre seu papel na saúde humana e patologia da doença ainda permanecem sem resposta. Os efeitos de muitos moduladores comuns do microbioma do intestino (por exemplo, probióticos, prebióticos, antibióticos, transplantação fecal e infecções) na composição e nas funções metabólicas da microbiota intestinal permanecem pela maior parte indescritível. Além disso, o exame e validação desses efeitos in vivo é difícil, especialmente porque a maioria dos nutrientes e metabólitos produzidos pela microbiota intestinal são absorvidos ou eliminados simultaneamente e rapidamente no intestino; por conseguinte, a medição da produção, da quantidade e do tratamento destes metabolitos (por exemplo, SCFAs) in vivo continua a ser um desafio prático. De fato, modelos fisiológicos como animais e sujeitos humanos são críticos para determinar o papel do microbioma intestinal e sua modulação na saúde do hospedeiro, mas estes podem não ser adequados para a triagem em grande escala de diferentes tipos de moduladores de microbiomas devido à restrições éticas, monetárias ou temporais. Para este fim, os modelos in vitro e/ou ex vivo, como a cultura da microbiota intestinal in vitro e depois a intervenção com diferentes moduladores de microbiota, podem oferecer oportunidades de poupança de tempo e dinheiro e, portanto, podem permitir a triagem preliminar ou em grande escala de vários componentes (como probióticos, prebióticos e outros compostos intervencionistas) para examinar/prever seus efeitos sobre a diversidade de microbiota fecal, composição e perfis metabólicos. Estudos que utilizam tais sistemas in vitro e ex vivo do microbioma intestinal podem facilitar a compreensão das interações hospedeiro-microbioma que contribuem para a saúde e doença do hospedeiro, podendo também levar a encontrar novas terapias que visam o microbioma a melhorar a saúde do hospedeiro e prevenir e tratar várias doenças1.
Embora os sistemas in vitro da cultura da microbiota do intestino não possam verdadeiramente replicar as condições intestinais reais, diversos laboratórios esforçou-se para desenvolver tais modelos, alguns de que foram encontrados praticáveis até certo ponto e foram usados com sucesso para diferentes finalidades. Um dos modelos recentes do intestino é o simulador do ecossistema microbiano intestinal humano, que imita todo o trato gastrointestinal humano, incluindo o estômago, intestino delgado, e diferentes regiões do cólon. No entanto, tais modelos tecnicamente complexos podem não ser acessíveis a outras instalações de pesquisa em todo o mundo. Portanto, ainda há uma necessidade crítica para o desenvolvimento de novos modelos alternativos que são relativamente simples, acessíveis e práticos para laboratórios que estudam os moduladores de microbioma e seus efeitos na microbiota intestinal e na saúde do hospedeiro. Assim, o uso de um sistema de cultura da microbiota fecal in vitro (ou ex vivo) seria útil para o estudo dos efeitos de tais intervenções11,12. Especificamente, o efeito de diferentes prebióticos sobre a capacidade de fermentação da microbiota em termos de mudanças periódicas na diversidade e composição da microbiota intestinal, o pH fecal e os níveis de metabólitos microbianos, incluindo SCFAs e lactato, podem ser estudados 13. nisto, usando inulina (um dos componentes prebióticos mais estudados) como exemplo do modulador de microbioma, é descrito um protocolo passo a passo deste sistema simples de cultura de lotes ex vivo de microbiota para demonstrar seu uso para estimar a alterações na microbiota fecal e metabólitos microbianos após a intervenção com os moduladores de microbioma.
Protocol
Representative Results
Discussion
O modelo de fermentação fecal in vitro aqui apresentado é um modelo simples de lote único para aproximar os efeitos de diferentes substratos e cepas microbianas (por exemplo, prebióticos e probióticos) sobre a composição da microbiota fecal humana, bem como sua atividades metabólicas em termos de pH fecal e níveis de SCFAs. Os resultados aqui apresentados demonstram que a inoculação da inulina diminui o pH fecal e aumenta significativamente os níveis de SCFAs e lactato em espécimes fecais tratados com inuli…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem com gratidão o apoio ao financiamento do centro de diabetes, obesidade e metabolismo e o centro de ciência clínica e translacional, a escola de medicina Wake Forest, o departamento de financiamento da defesa (número Grant: W81XWH-18-1-0118), a cadeira Kermit Glenn Phillips II em medicina cardiovascular; os institutos nacionais de saúde financiaram Claude D. Pepper mais velhos americanos centro (financiado por P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 e o centro de ciência clínica e translacional (unidade de pesquisa clínica, financiado por UL1TR001420), também é reconhecido felizmente. Agradecemos também aos voluntários por fornecer amostras fecais, e nossos outros membros do laboratório por suas ajudas técnicas durante este experimento.
Materials
| Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
| Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
| DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
| Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
| Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
| Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
| Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
| Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
| N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
| P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
| Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
| Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
| Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
| Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
| Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| 0.22 µm membrane filter | |||
| AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
| Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
| Bottle filter | Corning | ||
| Cheesecloth | |||
| Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
| pH meter | |||
| Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
| Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
| Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
| Vortex | Thermoscientific | ||
| Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |
Riferimenti
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