Questi protocolli sono stati sviluppati per analizzare la morfologia delle lenti corticali, l'integrità strutturale delle suture delle lenti pesce zebra in lenti fisse e Live e per misurare la posizione del nucleo della lente pesce zebra lungo l'asse anteriore-posteriore.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Valutazione del nucleo di lenti zebrafish localizzazione e integrità suturale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il pesce zebra è particolarmente adatto alla manipolazione genetica e all'imaging in vivo , rendendolo un modello sempre più diffuso per gli studi genetici inversi e per la generazione di transgeniche per l'imaging in vivo . Queste capacità uniche rendono il pesce zebra una piattaforma ideale per studiare lo sviluppo e la fisiologia delle lenti oculari. I nostri recenti risultati che un aquaporin-0, Aqp0a, è necessario per la stabilità della sutura dell'obiettivo anteriore, così come per lo spostamento del nucleo della lente al centro dell'obiettivo con l'età ci ha portato a sviluppare strumenti particolarmente adatti ad analizzare le proprietà delle lenti pesce zebra. Qui delineamo metodi dettagliati per la dissezione delle lenti che possono essere applicate sia alle lenti larvale che agli adulti, per prepararle per l'analisi istologica, l'immunoistochimica e l'imaging. Ci concentriamo sull'analisi dell'integrità della sutura dell'obiettivo e della morfologia delle cellule corticali e confrontiamo i dati generati dalle lenti dissezionate con i dati ottenuti dall'imaging in vivo della morfologia delle lenti resa possibile da una nuova linea di pesce zebra transgenica con un geneticamente marcatore fluorescente codificato. L'analisi delle lenti dissezionate perpendicolari al loro asse ottico consente di quantificare la posizione relativa del nucleo dell'obiettivo lungo l'asse anteriore-posteriore. Il movimento del nucleo dell'obiettivo da una posizione anteriore iniziale al centro è necessario per le ottiche lente normali nel pesce zebra adulto. Pertanto, una misura quantitativa della posizione nucleare dell'obiettivo è direttamente correlata alle sue proprietà ottiche.
Introduzione
Il pesce zebra è un ottimo modello per studiare lo sviluppo e la fisiologia delle lenti a causa delle somiglianze anatomiche con le lenti dei mammiferi, la relativa facilità di manipolazione genetica e farmacologica, la velocità di sviluppo embrionale degli occhi, le piccole dimensioni e la trasparenza fasi iniziali che consentono l'imaging in vivo . I metodi qui descritti sono stati sviluppati per analizzare la morfologia delle lenti pesce zebra a stadi embrionali e adulti con particolare attenzione all'integrità suturale, alla morfologia della membrana corticale in vitro e in vivoe alla posizione della posizione nucleare dell'obiettivo lun....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
I protocolli animali utilizzati in questo studio aderiscono alla dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università della California, Irvine.
1. allevamento di zebrafish e eutanasia
- Sollevare e mantenere il pesce zebra (ceppo AB) in condizioni di laboratorio standard12. Sollevare embrioni nel mezzo embrionale (EM)12. Aggiungere 0,003% PTU a EM da 20-24 h post fertilization (prima della fase Prim-5) per prevenire la formazione di pigmenti in embr....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
L'anatomia degli occhi di pesce zebra adulto assomiglia molto a quella dei mammiferi (Figura 1a). Nonostante alcune differenze tra gli occhi di pesce zebra e mammiferi, come avere una zona ciliare invece di un corpo ciliare17, differenze nelle proprietà ottiche18, e differenze nella morfogenesi durante lo sviluppo embrionale19, il pesce zebra Eye è un ottimo modello per studiare lo svilup.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
L'analisi della morfologia delle lenti pesce zebra è il primo passo nella comprensione dei fenotipi nei mutanti, o degli effetti degli interventi farmacologici finalizzati allo studio della biologia della lente oculare. Delineamo metodi per analizzare le suture lente, la morfologia delle cellule della fibra corticale e gli aspetti del nucleo della lente. Questi approcci sono una combinazione di in vitro e in vivo (rispetto alla tabella 1). I metodi in vitro consentono un maggio.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Non abbiamo divulgazioni.
Ringraziamenti
Vorremmo riconoscere la nostra fonte di finanziamento: NIH R01 EY05661 a J. E. H, Ines Gehring per aver assistito alla generazione del aqp0a/b doppio mutanti e allevamento di pesce zebra, Dr Daniel dranow per le discussioni che portano alla generazione dei transgenici, il dottor Bruce I laboratori di Blumberg e Dr Ken Cho per l'uso dei loro microscopi dissezione, e il dottor Megan Smith per l'aiuto con l'analisi statistica.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1-fenil-2-tiourea (PTU) | Sigma | P7629 | ATTENZIONE - soluzione |
| acquosa di paraformaldeide al 4% | Microscopia elettronica Scienze | RT 157-4 | ATTENZIONE - pericolo per la salute, combustibile |
| Microscopio confocale | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | Temperatura dell'obiettivo e della camera impostata su -21 e Deg; C |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | ATTENZIONE - irritante per gli occhi e la pelle |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Fisher Scientific | D128 | ATTENZIONE - combustibile, penetra nella pelle |
| Stampo base monouso | VWR Scientific | 15154-631 | |
| Pipette monouso in vetro Pasteur | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Dumont #5 pinze | Dumont & Fils | Mantieni la pinza affilata | |
| Etile 3-amminobenzoato sale metanosulfonato (Tricaina) | Sigma-Aldrich | A5040 | ATTENZIONE - tossico |
| Piatto per micropozzetti con fondo in vetro (piastra di Petri da 35 mm, micropozzetto da 14 mm, vetro di copertura #1.5) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Glicerolo | Sigma | G2025 | |
| huβ B1cry:mAppleCAAX DNA construct | Addgene | ID:122451 | |
| ImageJ | Wayne Rasband, NIH | v1.51n | |
| Low Melt Agarose (LMA) | Apex | 902-36-6 | |
| NIS-Elements | Nikon | V 4.5 | |
| NIS-Elements AR software | Nikon | ||
| Olympus con un modello 2.1.1.183 controller | Olympus Corp | Microscopio DP70 | |
| Olympus | Olympus Corp | SZX12 | |
| Falloidina-Alexa Farina 546 | Thermo Fisher | A22283 | |
| Fenolo Indicatore rosso (1% p/v) | Ricca Chemical Company | 5725-16 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Fisher Scientific | BP399 | |
| Photoshop | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Photoshop Software | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Piano Apo 60x/1.2 WD obiettivo | Nikon | ||
| Fonte di alimentazione | Wild Heerbrugg | MTr 22 | O fonte di alimentazione equivalente |
| Scaldavetrini modello n. 26020FS | Fisher Scientific | 12-594 | |
| Perle di idrossido di sodio | Fisher Scientific | S612-3 | ATTENZIONE - corrosivo/irritante per gli occhi e la pelle, organo bersaglio - sistema respiratorio, corrosivo per metalli |
| Vetrino per microscopio Superfrost/Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sylgard 184 silicone Dow Corning | World Prevision Instruments | ||
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Triton X-100 BioXtra | Sigma | T9284 | ATTENZIONE – Forbici per microdissezione Vannas tossiche, pericolose per l'ambiente acquatico, corrosive |
| Ted Pella Inc | 1346 | Punte dritte affilate/affilate | |
| Vectashield mezzo di montaggio antisbiadimento | Laboratori vettoriali | H-1000 | |
| Agglutinina del germe di grano (WGA)-Alexa Flour-594 | Life Technologies | W11262 |
Riferimenti
- Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
- Hall, J. E., Mathias, R. T. The Aquaporin Zero Puzzle. Biophysical Journal. 107 ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
