Avaliação da localização do núcleo da lente de zebrafish e integridade sutural

Summary

Estes protocolos foram desenvolvidos para analisar a morfologia da lente cortical, a integridade estrutural das suturas da lente do zebrafish em lentes fixas e vivas e para medir a posição do núcleo da lente do zebrafish ao longo do eixo anterior-posterior.

Abstract

O zebrafish é serido excepcionalmente à manipulação genética e à imagem latente in vivo , fazendo lhe um modelo cada vez mais popular para estudos genéticos reversos e para a geração de transgênicos para in vivo Imaging. Estas capacidades únicas fazem o zebrafish uma plataforma ideal para estudar o desenvolvimento e a fisiologia da lente da ocular. Nossos resultados recentes que um Aquaporin-Aqp0a, é exigido para a estabilidade da sutura anterior da lente, assim como para o deslocamento do núcleo da lente ao centro da lente com idade conduziu-nos desenvolver as ferramentas seridos especialmente para analisar as propriedades de lentes do zebrafish. Aqui nós esboçam métodos detalhados para a dissecção da lente que pode ser aplicada às lentes larval e adultas, para prepará-las para a análise histológica, immunohistochemistry e imagem latente. Nós focalizamos na análise da integridade da sutura da lente e da morfologia da pilha cortical e comparar dados gerados das lentes dissecadas com os dados obtidos da imagem latente in vivo da morfologia da lente feita possível por uma linha transgénica nova do zebrafish com um geneticamente marcador fluorescente codificado. A análise das lentes dissecadas perpendiculares ao seu eixo óptico permite quantificar a posição relativa do núcleo da lente ao longo do eixo ântero-posterior. O movimento do núcleo da lente de uma posição anterior inicial ao centro é exigido para o sistema ótico normal da lente no zebrafish adulto. Assim, uma medida quantitativa da posição nuclear da lente correlaciona-se diretamente com suas propriedades óticas.

Introduction

O zebrafish é um modelo excelente para estudar o desenvolvimento e a fisiologia da lente devido às similaridades anatômicas às lentes de mamíferos, à facilidade relativa da manipulação genética e farmacológica, à velocidade do desenvolvimento embrionário do olho, ao tamanho pequeno e à transparência em estágios iniciais permitindo in vivo Imaging. Os métodos descritos aqui foram desenvolvidos para analisar a morfologia da lente zebrafish em estágios embrionários e adultos com foco na integridade sutural, morfologia da membrana cortical in vitro e in vivo, e localização da posição nuclear da lente ao longo do eixo ântero-posterior ex vivo. Estes métodos servem como um ponto de partida para estudos funcionais do desenvolvimento e da fisiologia da lente, assim como telas genéticas reversas para fenótipos da lente no zebrafish.

Morfologia da lente do zebrafish da imagem latente

Aquaporin 0 (AQP0) é a proteína mais abundante da membrana da lente e é crítico para o desenvolvimento da lente e a claridade, devido às funções essenciais múltiplas nos mamíferos. Zebrafish tem dois Aqp0s (Aqp0a e Aqp0b) e nós desenvolvemos métodos para analisar a perda de suas funções nas lentes embrionárias e adultas. Nossos estudos revelam que aqp0a^-/-mutantes desenvolvem a opacidade polar anterior devido à instabilidade da sutura anterior, e aqp0a/b os mutantes duplos desenvolvem a opacidade nuclear¹. AQP0 tem demonstrado desempenhar papéis no transporte de água², adesão^3,4, fixação citoesquelética⁵ e geração do gradiente de índice de refração⁶, mas estes estudos foram amplamente realizados em em vitro. O zebrafish fornece uma oportunidade única de estudar como a perda de função, ou a função perturbada de Aqp0a ou Aqp0b afetaria a morfologia e a função em uma lente viva. Para avaliar a morfologia das células da lente e a integridade sutural durante o desenvolvimento, modificamos os métodos imunohistoquímicos in vitro existentes⁷ para uso em lentes embrionárias e adultas, e geramos transgênicos para monitorar esse processo in vivo .

A análise de immunohistochemical da estrutura da membrana do plasma e da integridade sutural foi executada em embriões fixos inteiros e em lentes adultas. As lentes de zebrafish são extremamente pequenas (o diâmetro da lente é ~ 100 μm nos embriões e até 1 milímetro nos adultos) comparados com seus homólogos mamíferos e tem as suturas de ponto⁸, que são capturadas infrequëntemente nos Cryosections. Assim, as lentes inteiras são essenciais para analisar a integridade sutural. Para a análise in vivo da formação anterior da sutura, e a imagem latente da arquitetura precisa da pilha da lente, nós geramos transgênicos expressando Mapple especificamente as membranas de rotulagem da lente.

As vantagens da imagem latente viva de transgênicos da membrana da lente incluem: 1) evitando artefatos da fixação, 2) estudando mudanças morfológicas dinâmicas em filmes do tempo-lapso, e 3) permitindo estudos longitudinais em que os eventos mais adiantados podem ser correlacionados com mais tarde Fenótipos. A pigmentação da íris impede normalmente a imagem latente desobstruída da periferia da lente. A adição de 1-phenyl 2-thiourea (PTU) antes do primordia-5 (Prim-5) estágio⁹ impede o melanogênese e a pigmentação do olho até ao redor 4 dias postfertilização (DPF). No entanto, após 4 DPF, a periferia da lente é obscurecida in vivo, particularmente em estágios mais antigos. Além disso, a densidade da lente própria obscurece a imagem latente de seu pólo do posterior. Portanto, para estudar a morfologia da periferia da lente, ou a sutura posterior, após 4 DPF, as lentes precisam ser excisadas e fixas.

As linhas de zebrafish transgênicas têm sido utilizadas para analisar a estrutura da membrana da lente embrionária in vivo¹⁰. O Q01 transgênicas expressa uma proteína fluorescente ciano fundida a uma seqüência da segmentação da membrana, Gap43, conduzida pelo promotor EF1α e por um hexamer do elemento de DF4 pax6 Enhancer ubiquitously em pilhas de fibra da lente¹¹. Q01 tem a expressão extra-lenticular, incluindo as pilhas do amácrinas no retina, que adiciona o sinal do fundo se o interesse preliminar é a lente. Nós desenvolvemos uma linha transgénica nova que expresse um mApple membrana-tethered especificamente na lente, com a finalidade de evitar todo o sinal extra-lenticular.

Localização do núcleo da lente

Nós descobrimos que o núcleo da lente se move de uma posição anterior inicial no zebrafish larval a uma posição central no eixo anterior-posterior em lentes adultas. Esta mudança na posição do núcleo elevado da lente do índice refração é pensada para ser uma exigência para o desenvolvimento normal do sistema ótico da lente do zebrafish¹. Nossos métodos permitem a quantificação da centralização nuclear da lente em relação ao raio da lente. Usando este método, nós mostramos que Aqp0a é exigido para a centralização nuclear da lente¹, e este método simples pode ser aplicado a outros estudos do desenvolvimento e da fisiologia da lente e de suas propriedades óticas no modelo do zebrafish.

Protocol

Os protocolos animais utilizados neste estudo aderem à declaração de ARVO para o uso de animais em pesquisa oftalmológica e visão e foram aprovados pelo Comitê de cuidados e uso de animais institucionais (IACUC) da Universidade da Califórnia, Irvine. 1. husbandry de zebrafish e eutanásia Elevar e manter o zebrafish (cepa AB) condições laboratoriais padrão12. Elevar embriões em meio embrionário (EM)12. Adicionar 0, 3…

Representative Results

A anatomia ocular adulta do zebrafish assemelha-se pròxima àquela dos mamíferos (Figura 1a). Apesar de algumas diferenças entre os olhos de zebrafish e de mamíferos, tais como ter uma zona ciliar em vez de um corpo ciliar17, diferenças em propriedades óticas18, e diferenças na morfogênese durante o desenvolvimento embrionário19, o o olho de zebrafish é um modelo excelente para …

Discussion

A análise da morfologia da lente zebrafish é o passo inicial na compreensão de fenótipos em mutantes, ou os efeitos de intervenções farmacológicas destinadas a estudar a biologia da lente ocular. Nós esboçam métodos para analisar suturas da lente, morfologia cortical da pilha da fibra e aspectos do núcleo da lente. Estas abordagens são uma combinação de in vitro e in vivo (em comparação com a tabela 1). Os métodos in vitro permitem maior detalhamento da morfolo…

Materials

1-phenyl-2-thiourea (PTU)	Sigma	P7629	CAUTION – very toxic
4% Paraformaldehyde aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	RT 157-4	CAUTION – health hazard, combustible
Confocal microscope	Nikon	Eclipse Ti-E
Cryostat	Leica	CM3050S	Objective and chamber temperature set to -21˚C
DAPI	Invitrogen	D1306	CAUTION – irritating to eyes and skin
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D128	CAUTION – combustible, penetrates skin
Disposable base mold	VWR Scientific	15154-631
Disposable Pasteur glass pipets	Fisherbrand	13-678-20A
Dumont # 5 forceps	Dumont & Fils		Keep forceps sharpened
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040	CAUTION – toxic
Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Glycerol	Sigma	G2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct	Addgene	ID:122451
ImageJ	Wayne Rasband, NIH	v1.51n
Low Melt Agarose (LMA)	Apex	902-36-6
NIS-Elements	Nikon	V 4.5
NIS-Elements AR software	Nikon
Olympus  with a model 2.1.1.183 controller	Olympus Corp	DP70
Olympus microscope	Olympus Corp	SZX12
Phalloidin-Alexa Flour 546	Thermo Fisher	A22283
Phenol Red indicator (1% w/v)	Ricca Chemical Company	5725-16
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399
Photoshop	Adobe	CS5 v12.0
Photoshop software	Adobe	CS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD objective	Nikon
Power source	Wild Heerbrugg	MTr 22	Or equivalent power source
Slide warmer model No. 26020FS	Fisher Scientific	12-594
Sodium Hydroxide beads	Fisher Scientific	S612-3	CAUTION – corrosive/irritating to eyes and skin, target organ – respiratory system, corrosive to metals
Superfrost/Plus microscope slide	Fisher Scientific	12-550-15
Sylgard 184 silicone Dow Corning	World Prevision Instruments	SYLG184
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583
Triton X-100 BioXtra	Sigma	T9284	CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive
Vannas micro-dissection scissors	Ted Pella Inc	1346	Sharp/sharp straight tips
Vectashield antifade mouting medium	Vector laboratories	H-1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594	Life Technologies	W11262