Disse protokoller blev udviklet til at analysere kortikale linse morfologi, strukturel integritet af: zebrafisk linse suturer i faste og levende linser og til at målepositionen af zebrafisklinsen kerne langs den forreste-posteriore akse.
Den zebrafisk er unikt egnet til genetisk manipulation og in vivo Imaging, hvilket gør det til en stadig mere populær model for reverse genetiske undersøgelser og for generation af transgenics for in vivo Imaging. Disse unikke kapaciteter gør Zebrafisken til en ideel platform til at studere okulær linse udvikling og fysiologi. Vores nylige fund, at en aquaporin-0, Aqp0a, er nødvendig for stabiliteten af den forreste linse sutur, samt for skiftet af linsen kerne til linsen Center med alderen førte os til at udvikle værktøjer specielt velegnet til at analysere egenskaberne af: zebrafisk linser. Her skitserer vi detaljerede metoder til linse dissektion, der kan anvendes til både larve og voksne linser, til at forberede dem til histologisk analyse, immunhistokemi og billeddannelse. Vi fokuserer på analyse af linse sutur integritet og kortikale celle morfologi og sammenligne data genereret fra dissekerede linser med data fra in vivo billedbehandling af linse morfologi muliggjort af en roman transgene: zebrafisk linje med en genetisk kodede fluorescerende markør. Analyse af dissekerede linser vinkelret på deres optiske akse gør det muligt at kvantificere den relative position af linse kernen langs den forreste-posteriore akse. Bevægelse af linse kernen fra en indledende forreste position til centrum er nødvendig for normal linse optik i voksne zebrafisk. Således en kvantitativ måling af linsen nukleare position direkte korrelerer med sine optiske egenskaber.
Den: zebrafisk er en glimrende model for at studere linse udvikling og fysiologi på grund af de anatomiske ligheder med pattedyrs linser, relativ lethed af genetiske og farmakologiske manipulation, hastighed af embryonale øjen udvikling, lille størrelse og gennemsigtighed tidligt stadie, hvilket muliggør in vivo -billeddiagnostik. De metoder, der er beskrevet her blev udviklet til at analysere: zebrafisk linse morfologi på embryonale og voksne stadier med fokus på den suturmæssige integritet, kortikale membran morfologi in vitro og in vivo, og placeringen af linsen nukleare position langs forreste-posteriort akse ex vivo. Disse metoder tjener som udgangspunkt for funktionelle undersøgelser af linse udvikling og fysiologi, samt omvendte genetiske skærme til linse fænotyper i zebrafish.
Billeddannende zebrafisklinse morfologi
Aquaporin 0 (AQP0) er den mest rigelige linse membran protein og er afgørende for både linse udvikling og klarhed, på grund af flere væsentlige funktioner i pattedyr. Zebrafish har to Aqp0s (Aqp0a og Aqp0b), og vi har udviklet metoder til at analysere tabet af deres funktioner i både embryonale og voksne linser. Vores undersøgelser afslører, ataqp0a-/-mutanter udvikler forreste polær uigennemsigtighed på grund af ustabilitet i den forreste sutur, og aqp0a/b dobbelt mutanter udvikler nuklear opacitet1. AQP0 har vist sig at spille roller i vand transport2, vedhæftning3,4, cytoskeletale forankring5 og generering af brydningsindeks gradient6, men disse undersøgelser er stort set blevet udført i vitro-diagnostik. Den: zebrafisk giver en unik mulighed for at studere, hvordan tab af funktion, eller forstyrres funktion af Aqp0a eller Aqp0b ville påvirke morfologi og funktion i en levende linse. For at vurdere cellernes morfologi og den kulturelle integritet under udviklingen ændrede vi eksisterende in vitro immunohistokemiske metoder7 til brug i embryonale og voksne linser og genererede transgenics til at overvåge denne proces in vivo .
Immunohistokemisk analyse af plasma membran struktur og den suturmæssige integritet blev udført i hele faste embryoner og voksne linser. Zebrafish linser er ekstremt små (linse diameter er ~ 100 μm i embryoner og op til 1 mm hos voksne) sammenlignet med deres pattedyr-modparter og har punkt suturer8, som sjældent fanges i kryosektioner. Således hele linser er afgørende for at analysere den kulturelle integritet. Til in vivo analyse af forreste sutur dannelse, og billeddannelse af præcis linse celle arkitektur, genererede vi transgenics udtrykker Mapple specifikt mærkning linse membraner.
Fordele ved levende billeddannelse af linse membran transgenics omfatter: 1) undgå fiksering artefakter, 2) studere dynamiske morfologiske ændringer i time-lapse film, og 3) muliggør langsgående undersøgelser, hvor tidligere begivenheder kan korreleres med senere Fænotyper. Pigmentering af iris forhindrer normalt klar billeddannelse af objektivets periferi. Tilsætning af 1-phenyl 2-thiourea (PTU) før primordia-5 (Prim-5) stadie9 forhindrer melanogenese og øjen pigmentering op til omkring 4 dage efter befrugtning (DPF). Efter 4 DPF skjules objektivets periferi dog in vivo, især i ældre stadier. Endvidere, tætheden af linsen selv tilslører billeddannelse af sin posterior stang. Derfor, for at studere morfologi af linsen periferi, eller posterior sutur, efter 4 DPF, linser skal være fjernet og fast.
Transgene: zebrafisk linjer er blevet anvendt til at analysere embryonale linse membran struktur i vivo10. Q01 transgene udtrykker et cyan fluorescerende protein, der er smeltet til en membran målretnings sekvens, Gap43, drevet af EF1α promoter og en hexamer af DF4 PAX6 forstærker-elementet allestedsnærværende i linse fiber celler11. Q01 har ekstra-lenkulære udtryk, herunder amacrine celler i nethinden, som tilføjer baggrunds signal, hvis den primære interesse er linsen. Vi udviklede en roman transgene linje, der udtrykker en membran-tøjret mApple specifikt i linsen, med det formål at undgå enhver ekstra-linse-signal.
Lokalisering af linse kerne
Vi opdagede, at linse kernen bevæger sig fra en indledende forreste placering i larve: zebrafisk til en central placering i den forreste-posterior akse i voksne linser. Dette skift i positionen af den høje brydningsindeks linse kerne menes at være et krav til normal udvikling af: zebrafisk linse optik1. Vores metoder muliggør kvantificering af objektivets nukleare centralisering i forhold til linse radius. Ved hjælp af denne metode, vi viste, at Aqp0a er nødvendig for linse nuklear centralisering1, og denne enkle metode kan anvendes til andre undersøgelser af udviklingen og fysiologi af linsen og dens optiske egenskaber i: zebrafisk model.
Analyse af: zebrafisk linse morfologi er det første skridt til at forstå fænotyper i mutanter, eller virkningerne af farmakologiske interventioner rettet mod at studere biologi af okulær linse. Vi skitserer metoder til at analysere linse suturer, kortikale fiber celle morfologi og aspekter af linsen kerne. Disse tilgange er en kombination af in vitro og in vivo (sammenlignet i tabel 1). In vitro metoderne giver mulighed for større detaljering af den ydre kortikale cellers …
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne anerkende vores finansieringskilde: NIH R01 EY05661 til J. E. H, Ines gehring for at hjælpe med at generere aqp0a/b dobbelt mutanter og: zebrafisk opdræt, Dr. Daniel dranow for diskussioner, der fører til generation af transgenics, Dr. Bruce Blumberg og Dr. Ken Cho’s laboratorier for brug af deres dissekere mikroskoper, og Dr. Megan Smith for hjælp med statistisk analyse.
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | CAUTION – very toxic |
4% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 157-4 | CAUTION – health hazard, combustible |
Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
Cryostat | Leica | CM3050S | Objective and chamber temperature set to -21˚C |
DAPI | Invitrogen | D1306 | CAUTION – irritating to eyes and skin |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128 | CAUTION – combustible, penetrates skin |
Disposable base mold | VWR Scientific | 15154-631 | |
Disposable Pasteur glass pipets | Fisherbrand | 13-678-20A | |
Dumont # 5 forceps | Dumont & Fils | Keep forceps sharpened | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | CAUTION – toxic |
Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
Glycerol | Sigma | G2025 | |
huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct | Addgene | ID:122451 | |
ImageJ | Wayne Rasband, NIH | v1.51n | |
Low Melt Agarose (LMA) | Apex | 902-36-6 | |
NIS-Elements | Nikon | V 4.5 | |
NIS-Elements AR software | Nikon | ||
Olympus with a model 2.1.1.183 controller | Olympus Corp | DP70 | |
Olympus microscope | Olympus Corp | SZX12 | |
Phalloidin-Alexa Flour 546 | Thermo Fisher | A22283 | |
Phenol Red indicator (1% w/v) | Ricca Chemical Company | 5725-16 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399 | |
Photoshop | Adobe | CS5 v12.0 | |
Photoshop software | Adobe | CS5 v12.0 | |
Plan Apo 60x/1.2 WD objective | Nikon | ||
Power source | Wild Heerbrugg | MTr 22 | Or equivalent power source |
Slide warmer model No. 26020FS | Fisher Scientific | 12-594 | |
Sodium Hydroxide beads | Fisher Scientific | S612-3 | CAUTION – corrosive/irritating to eyes and skin, target organ – respiratory system, corrosive to metals |
Superfrost/Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Sylgard 184 silicone Dow Corning | World Prevision Instruments | SYLG184 | |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
Triton X-100 BioXtra | Sigma | T9284 | CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive |
Vannas micro-dissection scissors | Ted Pella Inc | 1346 | Sharp/sharp straight tips |
Vectashield antifade mouting medium | Vector laboratories | H-1000 | |
Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 | Life Technologies | W11262 |