Aqui, nós apresentamos uma aproximação combinatória usando a microscopia de alta resolução, as ferramentas computacionais, e a rotulagem da único-pilha em embriões vivos de C. elegans para compreender a única dinâmica da pilha durante o neurodevelopment.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) destaca-se como o único organismo em que o desafio de compreender as origens celulares de um sistema nervoso inteiro pode ser observado, com resolução de células únicas, in vivo. Aqui, apresentamos um protocolo integrado para o exame do neurodesenvolvimento em embriões de C. elegans . Nosso protocolo combina a imagem latente, o lineaging e o traçado neuroanatômico de únicas pilhas em embriões tornando-se. Nós alcançamos a imagem latente a longo prazo, Four-dimensional (4D) de embriões vivos de C. elegans com a definição espacial quase isotrópico com o uso da microscopia de iluminação de plano seletivo invertida da Duplo-Vista (dispim). Núcleos e estruturas neuronais nos embriões de nematódeos são imaged e fundidos isotropicamente para produzir imagens com resolução de ~ 330 nm em todas as três dimensões. Esses conjuntos de dados 4D de alta resolução minuto a minuto são então analisados para correlacionar identidades definitivas de linhagem celular com expressão gênica e dinâmica morfológica em níveis de detalhe de células únicas e subcelulares. Nosso protocolo está estruturado para possibilitar a implementação modular de cada uma das etapas descritas e aprimorar estudos sobre embriogênese, expressão gênica ou neurodesenvolvimento.
C. elegans destaca-se como o único organismo em que cada célula do embrião pode ser observada em todo o neurodesenvolvimento. Com toda a linhagem celular conhecida e invariante1, e com o desenvolvimento de novas ferramentas que permitem a rotulagem e a imagem contínua de células individuais em embriões, os biólogos podem agora começar a examinar diferentes etapas no desenvolvimento do nematoide nervoso sistema de todos os ângulos-células de nascimento; migração e diferenciação; formação de neurite, crescimento direcionado e fasciculação; formação de sinapse; e sintonia de circuitos funcionais. A captura de dinâmicas de crescimento neuronal no embrião C. elegans , combinando repórteres e microscopia de fluorescência de forma estavelmente expressa, é valiosa para a comunidade científica.
Estudos de desenvolvimento em C. elegans costumam alavancar os mapas invariantes da linhagem celular e do destino celular desta espécie para aumentar a compreensão contextual no nível de célula única dentro do organismo intacto1. Auto-análise de lineaging-usando starrynite2,3,4 e acetree5,6, 7,8 software-benefícios de alto contraste, alta resolução imagens de núcleos fluorescentes. Para trabalhar otimamente, StarryNite/AceTree também depende da orientação restrita previsível de embriões imaged durante o desenvolvimento. A microscopia confocal, feita em embriões de C. elegans comprimida entre dois COVERSLIP, foi o método padrão da microscopia da auto-lineaging por mais de uma década porque fornece o elevado contraste/alta resolução e um restrito previsível orientação do embrião7,8. Nós descrevemos previamente a construção e o uso de um microscópio plano seletivo invertido luz-folha-baseado novela da iluminação da Duplo-Vista (dispim) para a imagem latente viva da amostra tal como o C. elegans embriogênese9,10 , 11 anos de , 12 anos de , 13. a microscopia da luz-folha, geralmente, fornece a baixa fototoxicidade, a alta velocidade, e a imagem latente a longo prazo de espécimes 3D vivos14,15. O método diSPIM, especificamente, produz imagens de quatro dimensões (4D) com resolução espacial quase isotrópica de aproximadamente 330 nm9.
Comparado com a microscopia confocal, dispim oferece um sinal-à-ruído e uma velocidade mais elevados, uma definição espacial mais isotrópico, e é mais apropriado para a imagem latente in vivo de longo prazo16. Por isso, trabalhamos para adaptar os dados de diSPIM para entrada em StarryNite/AceTree e investigamos se isso melhoraria as análises de lineaging. Um obstáculo principal é que os espécimes de diSPIM não podem facilmente ser restringidos pela casca de ovo-compressão para adotar orientações esperadas para StarryNite/AceTree. A orientação aleatória das posições das células no volume que está sendo analisado degrada a precisão da análise de lineaging automático.
Por isso, empregamos o CytoSHOW, uma interface de usuário guiada por visualizador, que permite aos usuários selecionar a orientação 3D precisa de embriões durante o pré-processamento de imagens diSPIM, produzindo dados de imagem que são otimizados para a qualidade e com reconhecimento de contexto para entrada em StarryNite /AceTree. Após a seleção do usuário de embriões imaged, o CytoSHOW orquestra um pipeline automatizado de processamento de dados. As imagens cortadas e de fundo subtraída de embriões são salvas em arquivos de pilha TIFF para cada posição, ponto de tempo e exibição. O cytoshow, então, iterativamente chama o programa spimfusion para coinscrever-se e deconvolve conjuntamente as duas visualizações pré-processadas, usando o algoritmo Richardson-Lucy17,18 para produzir imagens volumétricas de alta resolução isotrópicas. Um conjunto dispim-specific dos parâmetros foi aperfeiçoado para que o starrynite governe seu comportamento durante a imagem-segmentação e o núcleo-seguimento em imagens isotropicamente fundidas. Imagens fundidas e resultados de lineaging são então editados usando AceTree, que permite aos usuários identificar e corrigir quaisquer erros no rastreamento de linhagem automática gerado pelo StarryNite. Acetree também pode apresentar linhagem-árvore e 3D modelado renderizações de núcleos rastreados no embrião. Nós achamos que a velocidade e a exatidão da auto-lineaging são realçadas marcada usando imagens isotropicamente fundidas, quando comparadas às imagens cruas de uma ou outra câmera de spim. Nosso protocolo, enquanto otimizado para o C. elegans aplicação descrita aqui, poderia ser geralmente adaptado para auto-lineaging de dispim dados produzidos para outras espécies ou espécimes. Se este for o uso pretendido do protocolo, por favor, note que a afinação adicional dos parâmetros starrynite provavelmente será necessária para novos espécimes, como descrito3,4.
A implementação bem-sucedida deste protocolo resulta em imagens com resolução 4D-isotrópica e permite que os biólogos rastreem linhagens celulares, identificando e analisando simultaneamente os neurônios no embrião C. elegans em desenvolvimento. Além disso, ao mesclar vários algoritmos de pós-processamento-com aceleração de hardware sendo o mais demorado destes-agora podemos analisar os detalhes subcelulares finos e as linhagens celulares e células-Fates de embriões vivos em tempo essencialmente real. Este novo protocolo permite a manipulação precisa, informada e a observação do comportamento celular durante estudos probatório de diferenciação e morfogênese in vivo. Neste manuscrito, apresentamos uma explicação detalhada dos protocolos melhorados que desenvolvemos para lineaging e rastreamento de células no desenvolvimento de embriões de C. elegans , para aprimorar estudos de embriogênese, expressão gênica ou neurodesenvolvimento.
C. elegans destaca-se como o único organismo com as posições finais e conectividade de cada neurônio adulto conhecido27. Entretanto, a dinâmica de desenvolvimento que conduz à organização dos circuitos e das redes de funcionamento que compõe o conectoma do C. elegans permanece desconhecida. Com base nas oportunidades emergentes dos avanços na microscopia de luz, podemos agora capturar e analisar as posições celulares, a morfogênese e a neurogênese em todo o desenvolvimento embrionário de C. elegans .
O procedimento que nós descrevemos e que nós usamos rotineiramente no laboratório rende imagens 4D-isotropic de neurônios e de núcleos etiquetados para o Cell-lineaging em embriões de C. elegans . Mais importante ainda, otimizamos as condições de imagem de longo prazo com as capacidades de lineaging diSPIM e acopladas semiautomatizadas com imagens de alta resolução para melhorar a velocidade e a precisão da análise da embriogênese C. elegans . Este protocolo integrado permitirá que os usuários visualizem e identifiquem pilhas e quantificar características tridimensionais tais como a migração do neurite e o fasciculação do AXON através do início de twitching adiantado. Este procedimento pode prontamente ser adaptado em toda a facilidade com um sistema do diSPIM de ASI, e nós recomendamos este sistema especificamente para este protocolo. Outras formulações SPIM oferecidas comercialmente podem diferir da configuração de ASI na câmara de amostra e nas propriedades ópticas. No entanto, os dados exportados de outras plataformas também podem ser colocados através do nosso pipeline de dados. Portanto, a avaliação de seu valor na lineaging, um teste exigente de qualidade de imagem e estabilidade do instrumento, é viável. Mesmo que nós usamos ativamente o diSPIM para imagem regularmente outros espécimes (tais como embriões de Drosophila e de zebrafish), a análise de lineaging descrita e detalhada dos embriões é limitada ainda atualmente às espécies do nematóide. Para amostras maiores ou grossas, optamos por usar abordagens de varredura de estágio, que digitaliza as amostras através de uma folha de luz estacionária. Kumar et al. demonstraram anteriormente este melhor seccionamento de diSPIM para produzir imagens de alta qualidade de amostras grossas sem modificações adicionais no diSPIM10.
As etapas críticas dentro do protocolo incluem a montagem de embriões C. elegans na cobertura revestida de poli-L-lisina, aquisição de dados e processamento de dados. Colheita e montagem de embriões C. elegans na cobertura de vidro pode ser desafiador para usuários inexperientes, mas aqui nós fornecemos um protocolo detalhado de passos-chave para facilitar a aprendizagem. Se a imagem latente a longo prazo é desejada, nós obtemos os melhores resultados que colhem embriões Four-Cell ou mais adiantados de 8-10 adultos novos28. Note-se que os idosos são menos desejáveis para a colheita de embriões fase inicial, porque eles tendem a conter embriões mais velhos no útero e ovos não fertilizados. No que diz respeito à montagem de embriões, problemas como o bloqueio no aspirador montado (pipeta bucal) ou um muito grande de uma abertura na pipeta microcapilar pode impedir a montagem adequada e orientação de embriões. Para se preparar para imagens ideais, realizamos testes de pré-aquisição em embriões pré-twitching precoces e atrasados para verificar o desempenho das folhas de luz, câmeras, objetivos e autofoco. Obtemos melhores resultados quando todas essas operações são testadas e produzem imagens de alta qualidade durante nossos testes de pré-aquisição. Isso é particularmente relevante para a geração de imagens com resolução espacial isotrópica, para as quais as imagens brutas adquiridas de ambos os pontos de vista (objetivos) devem ser de alta qualidade. Após a aquisição, os volumes adquiridos para cada vista são processados para produzir imagens isotrópicas. É importante usar um cartão de processamento gráfico apropriado (GPU) como descrito neste protocolo (veja abaixo). Isto melhora a velocidade de processamento em que as imagens isotropicamente fundidas são geradas, encurtando o tempo para análises de dados. Também é imperativo que os usuários estão executando a versão mais recente do CytoSHOW e estão usando os parâmetros fornecidos com o nosso pacote de download para StarryNite auto-lineaging. Se os usuários estão interessados em usar auto-lineaging para outras amostras (por exemplo, zebrafish, Drosophila etc.) então a otimização adicional aos parâmetros usados no starrynite será exigida (veja referências3,4).
Embora nosso protocolo integrado forneça imagens e resultados de lineaging no embrião pre-twitching, os usuários devem estar cientes que o lineaging automatizado no embrião post-twitching não é atualmente praticável: as posições nucleares mudam na ordem dos segundos no embrião pós-twitching, muito rapidamente para permitir o rastreamento de linhagem. No entanto, o dispim demonstrou, de fato, uma capacidade promissora para captar eventos de neurodesenvolvimento e rastrear algumas posições celulares nos estágios pós-espasmódios da embriogênese23,29. Se os usuários estão interessados em examinar o embrião pós-contração, o diSPIM fornece a velocidade para obter instantâneos volumétricos e rastrear eventos de neurodesenvolvimento finos, como o crescimento do neurite, em embriões em rápida mudança.
Este protocolo será fundamental para a conclusão célula a célula do Atlas de WormGUIDES30, pois fornecerá uma abordagem integrada com imagens isotrópicas de alta resolução para identificar e capturar morfologias 3D de neurônios rotulados durante os primeiros 430 minutos de embriogênese. Como está, o protótipo do Atlas WormGUIDES fornece posições nucleares de células no embrião em desenvolvimento e visa capturar a dinâmica de desenvolvimento de um subconjunto de neurônios embrionários. Este protocolo será uma chave para a integração de neurônios em desenvolvimento adicionais no Atlas de WormGUIDES30.
Nosso protocolo integrado também simplificará a exploração de novos perfis de expressão gênica no embrião C. elegans . Em C. eleganstransgénicos, muitos promotores Cell-specific espacialmente e controlam temporally a expressão do transgene. Embora os padrões de expressão da maioria dos genes tenham sido extensivamente caracterizados no animal adulto31,32,33,34, quase todos ainda têm de ser caracterizados no desenvolvimento (especialmente fase tardia) embrionário. O promoterome de C. elegans foi um recurso útil à comunidade do sem-fim para conduzir a expressão pilha-específica do transgene, assim como determina se a função do gene é pilha-autônoma ou não-autônoma. A captura de padrões de expressão dinâmica e de alta resolução isotrópicas de genes e a identificação precisa de células expressadas por meio de lineaging serão valiosas para muitos na comunidade científica.
A embryogênese compreende dois processos principais entrelaçados, diferenciação celular e morfogênese tecidual. Um grande negócio é sabido sobre os mecanismos e as moléculas que definem tipos distintos da pilha durante o desenvolvimento de C. elegans. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos importantes para a migração celular, adesão celular e forma celular no embrião C. elegans . Com a linhagem de células invariantes C. elegans conhecida, nosso protocolo nos permite discernir prontamente a 3D-microanatomia catalogada do embrião durante a morfogênese em novos níveis de detalhe: por exemplo, fasciculação do axão, sinaptogênese e atividade neuronal. Ardiel et al. demonstraram previamente o poder do diSPIM para capturar transientes de cálcio ao nível de um único neurônio em embriões de C. elegans 23. Muitos outros aspectos da fisiologia do desenvolvimento estão maduros para o inquérito por estes métodos.
Finalmente, este protocolo é em grande parte automatizado e reduz sistematicamente o tempo que leva para gerar imagens deconvolução e realizar a lineagem celular via StarryNite e Acetree. As estratégias de software utilizadas neste protocolo podem ser aplicadas a muitas questões de biologia distantes dos campos muito específicos em que os demonstramos aqui.
Detalhes sobre compatibilidade de software e acesso de download
Informações sobre micro-Manager e plugins para imagens diSPIM estão disponíveis em http://dispim.org/software/micro-manager e https://micro-manager.org/wiki/ASIdiSPIM_Plugin.
O pipeline de processamento de dados atualmente requer um sistema operacional Windows. Nós empacotamos um único arquivo de arquivamento para simplificar a instalação de todos os programas de processamento de dados necessários e arquivos de suporte. Está disponível para download em http://dispimlineage.wormguides.org.
CytoSHOW (http://run.cytoshow.org/) baseia-se na plataforma de análise de imagem de código aberto e amplamente utilizado, ImageJ (v1). O Java deve ser instalado e atualizado no computador para usar o CytoSHOW, e as atualizações do CytoSHOW são implantadas automaticamente via Java Web Start. Muitas funções baseadas em ImageJ do CytoSHOW são descritas e ilustradas em https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html. O CytoSHOW foi personalizado para exibir dados brutos multidimensionais do ASI diSPIM, bem como outros softwares de imagem que criam a saída TIFF. Em princípio, outros sistemas de imagiologia SPIM multivista podem ser apoiados por pequenas modificações do CytoSHOW para permitir que este protocolo seja realizado em diferentes sistemas de microscópio.
SpimFusion foi escrito em/C++ usando o Visual Studio 2013 com o kit de ferramentas do cubo v 7.5. Executar SpimFusion requer hardware de computador específico: uma placa de processamento de gráficos NVIDIA (GPU) com capacidade de computação de 1,0 ou superior e um mínimo de 2 GB de memória de placa gráfica. No momento da publicação do nosso protocolo, SpimFusion é inédita (min Guo e Hari Shroff), mas disponível no arquivo de pacote de software mencionado acima.
Uma versão de linha de comando especialmente construída do StarryNite requer que o runtime do compilador do MATLAB disponível livremente esteja instalado, mas não requer uma licença para o software MATLAB comercial. O MATLAB Compiler Runtime está incluído no arquivo de pacote de software mencionado acima. O código para StarryNite como usado neste protocolo é essencialmente inalterado daquele usado para imagens confocal6. No entanto, várias questões operacionais na criação de imagens de entrada para o processamento de StarryNite e o manuseio de resultados de StarryNite foram abordadas aqui por métodos no Citoshow que permitem um pipeline de processamento contínuo de dados para diSPIM isotrópico fundido Volumes. Essas alterações são automatizadas pelo código CytoSHOW que lida com essas etapas de pré e pós-processamento. O CytoSHOW também edita um parâmetro pré-otimizado de modelo específico de diSPIM StarryNite definido para ajustar automaticamente o algoritmo de segmentação à intensidade de fluorescência dos núcleos nos dados imaged. Os parâmetros exclusivos usados pelo StarryNite em cada conjunto de dados diSPIM são salvos em um arquivo junto com a imagem de saída e os dados de lineaging.
Uma versão personalizada do AceTree que funciona com imagens de 16 bits e mantém A compatibilidade com a renderização Java3D é mais adequada para este protocolo. Ele também está incluído no arquivo de pacote de software mencionado acima.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a John Murray por estirpe integrada, ujIs113, para gerar estirpe de lineaging BV514; Brandon Harvey (NIBIB) para obter ajuda com o teste do protocolo; Jon Daniels e Gary Rondeau (Instrumentação científica aplicada) para assistência com micro-gerente e diSPIM instrumento; e Andrew York e Hank Eden por seu feedback crítico sobre o sistema diSPIM. Agradecemos também o programa centro de pesquisa para instituições minoritárias e o Instituto de Neurobiología Jose del Castillo (Universidad de Puerto Rico) por fornecer uma plataforma de reunião e brainstorming. Grande parte deste trabalho foi conduzido no laboratório biológico marinho em Woods Hole através do programa Whitman. Este trabalho foi apoiado pelos programas de pesquisa intramural do NIH National Institute of Biomedical Imaging and BioEngineering e pela NIH Grant no. U01-HD075602 e não. R24-OD016474. Mark W. Moyle foi apoiado por F32-NS098616 e Leighton H. Duncan foi apoiado por um suplemento de diversidade para R24-OD016474.
Steps 1-4 | |||
Concavity slides | ThermoFisher Scientific | 1519006 | 5-18mm diameter, 0.6-0.8mm deep, 1.2-1.5mm |
Dissecting microscope with 10×–50× zoom range | Motic | SMZ-171 | |
E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
Glass coverslips, no. 1.5, 24 × 50 mm | VWR International | 48393-241 | |
M9 Buffer | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | H7509-25G | |
Microcapillary pipette aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
Microcapillary pipettes, 0.4-mm i.d | Drummond Scientific | 1-000-800 | |
Needle, no. 18G x 1 ½ (1.2mm x 40mm) | BD Precision Glide | 305196 | |
NGM plates | prepared as described by Brenner (1974) | ||
O-ring for imaging chamber | O-Rings West | M1.5X40 | |
Pasteur pipette | Corning/Sigma-Aldrich | CLS7095D5X | |
Platinum wire, 0.5-mm diameter | Sigma-Aldrich | 267201 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | |
Stainless steel rectangular chamber (76.0 mm x 50.5 mm) | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | I2450 | |
Worm Eyelash Pick | Hart, A. C. Behavior. WormBook. (2006). | ||
Worm Pick | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Steps 5-6 | |||
488 nm long-pass filter | Semrock | LP02-488 RU-2 | |
561-nm notch filter | Semrock | NF03-561E-25 | |
BLP02-561R-25, quantity 2 | Semrock | 561 nm EdgeBasic best-value long-pass edge filter | |
Control software for bottom camera | Jenoptik | ProgRes CapturePro | |
diSIPM assembly video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/TAgbr6IrTqw ; http://www.asiimaging.com | |
diSPIM alignment video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/qnOrg30NNuE | |
diSPIM imaging PC | Intel | Intel Xeon CPU E5-2630 2.6GHz, 12 cores in total, 64 GB memory, Windows 7 | |
FF01-525/45-25, quantity 2 | Semrock | 525/45 nm BrightLine single-band bandpass filter | |
FF555-DI03-25X36, quantity 2 | Semrock | 555 nm edge BrightLine single-edge dichroic beamsplitter | |
Imaging PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
Kumar et al diSPIM Setup | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | Instrument setup for this protocol is identical to Kumar et al 10,11 diSPIM, which makes use of 40x 0.8NA water immersion lenses for imaging. (See steps 5.1 and note) | |
Micro Manager | Micro-Manager | https://micro-manager.org/ | |
Modifications to Kumar et al diSPIM Setup (see below) | |||
Optical table with isolators, 4 feet × 6 feet × 12 inches | TMC | 784-651-02DR and 14-416-34 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Steps 7-10 | |||
Analysis PC | Intel | Intel Core i7-8700K CPU 3.70GHz, 6 cores in total, 64 GB memory, Windows 10 | |
Analysis PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
Installation instructions | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm | |
Software bundle | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org |