Metodi per testare la disgregazione endocrina nella Drosophila melanogaster

Sommario

Le sostanze chimiche interferenti endocrine (EDC) rappresentano un grave problema per gli organismi e per gli ambienti naturali. La Drosophila melanogaster rappresenta un modello ideale per studiare gli effetti della CED in vivo. Qui, presentiamo metodi per studiare la perturbazione endocrina nella Drosophila, affrontando gli effetti della CED sulla fecondità, la fertilità, i tempi di sviluppo e la durata della vita della mosca.

Abstract

Negli ultimi anni ci sono state sempre più prove che tutti gli organismi e l'ambiente sono esposti a sostanze chimiche ormonali-come, noto come sostanze chimiche interferenti endocrine (EDC). Queste sostanze chimiche possono alterare il normale equilibrio dei sistemi endocrini e portare a effetti negativi, nonché un numero crescente di disturbi ormonali nella popolazione umana o una crescita disturbata e una minore riproduzione nelle specie selvatiche. Per alcuni EDC, ci sono documentati effetti sulla salute e restrizioni sul loro uso. Tuttavia, per la maggior parte di loro, non c'è ancora alcuna prova scientifica in questo senso. Al fine di verificare potenziali effetti endocrini di una sostanza chimica nel tutto l'organismo, abbiamo bisogno di testarlo in sistemi modello appropriati, così come nel filo della frutta, Drosophila melanogaster. Qui riportiamo protocolli dettagliati in vivo per studiare la perturbazione endocrina nella Drosophila, affrontando gli effetti della CED sulla fecondità/fertilità, sui tempi di sviluppo e sulla durata della vita della mosca. Negli ultimi anni, abbiamo usato questi tratti della vita della Drosophila per studiare gli effetti dell'esposizione al 17-e-ethinylestradiol (EE2), al bisfenolo A (BPA) e al bisfenolo AF (BPA F). Complessivamente, questi saggi hanno coperto tutte le fasi della vita della Drosophila e hanno permesso di valutare la perturbazione endocrina in tutti i processi mediati dall'ormone. I saggi di fedia/fertilità e tempistica dello sviluppo sono stati utili per misurare l'impatto della CED sulle prestazioni riproduttive delle mosche e sugli stadi dello sviluppo, rispettivamente. Infine, il saggio della durata della vita ha coinvolto esposizioni croniche di EDC agli adulti e ha misurato la loro sopravvivenza. Tuttavia, questi tratti di vita possono anche essere influenzati da diversi fattori sperimentali che dovevano essere attentamente controllati. Quindi, in questo lavoro, suggeriamo una serie di procedure che abbiamo ottimizzato per il giusto risultato di questi saggi. Questi metodi consentono agli scienziati di stabilire interruzioni endocrine per qualsiasi EDC o per una miscela di diversi EDC in Drosophila, anche se per identificare il meccanismo endocrino responsabile dell'effetto, potrebbero essere necessari ulteriori saggi.

Introduzione

Le attività umane hanno rilasciato nell'ambiente una massiccia quantità di sostanze chimiche, che rappresentano un grave problema per gli organismi e per gli ecosistemi naturali¹. Di questi inquinanti, si stima che circa 1.000 sostanze chimiche diverse possano alterare il normale equilibrio dei sistemi endocrini; in base a questa proprietà, sono classificati come sostanze chimiche interferenti endocrine (EDC). In particolare, sulla base di una recente definizione della Società Endocrina, i CED sono "una sostanza chimica esogena, o miscela di sostanze chimiche, che può interferire con qualsiasi aspetto dell'azione ormonale"²

Protocollo

1. Preparazione degli alimenti

1. Per la manutenzione delle scorte e per la crescita larvale, utilizzare un mezzo di farina di mais contenente lievito in polvere del 3%, il 10 % di saccarosio, il 9 % di farina di mais precotta, lo 0,4% di agar, successivamente chiamato Cornmeal medium (CM).
   1. Mettere 30 g di lievito in 100 mL di acqua di rubinetto, portarla a ebollizione e far bollire per 15 min.
   2. Separatamente, mescolare bene 90 g di farina di mais precotta, 100 g di zucchero e 4 g di agar in 900 mL di acqua di rubinetto.
   3. Portare la soluzione a ebollizione, abbassare il fuoco e cuocere per 5 minuti mescolando cont....

Risultati

In questa sezione, i passaggi chiave dei protocolli di cui sopra sono riportati sotto forma di schemi semplificati. Dato che le mosche tendono ad evitare composti sgradevoli, la prima cosa da fare è quello di testare il gusto della CED selezionata. Questo può essere fatto mescolando una colorazione alimentare (ad esempio, colorante alimentare rosso n. 40)³⁵ con il cibo integrato con l'EDC selezionato a varie dosi o con il solvente da solo. Le mosche alimentate su questi mezzi di comunicazione sono.......

Discussione

Il fly d. melanogaster è stato ampiamente impiegato come sistema modello in vivo per studiare i potenziali effetti di EDC ambientali come DBP²⁸, BPA, 4-NP, 4-tert-OP²⁹, MP³⁰, EP^{31, 32}, DEHP³³ed EE2³⁴. Diverse ragioni hanno portato il suo utilizzo come modello in questo campo di ricerca. A parte i suoi indiscussi vantaggi come sistema m.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
17&alfa;-Etinilestradiolo	Sigma	E4876-1G
Agar per Drosophila medium	BIOSIGMA	789148
Bisfenolo A	Sigma	239658-50G
Bisfenolo AF	Sigma	90477-100MG
Farina di mais	CA' BIANCA
Etere dietilico	Sigma
Fiale di Drosophila	BIOSIGMA	789008	25 mm x 95 mm
Fiale di Drosophila	BIOSIGMA	789009	29 mm x 95 mm
Fiale di Drosophila	Kaltek	187	22 mm x 63 mm
Gabbia di raccolta embrioni	Crafts		Cilindro in plexiglass (12,5 mm x7 cm) con un'estremità aperta e l'altra estremità chiusa da una base rettangolare in cui una fessura consente l'inserimento di vassoi speciali per la posa
di etanolo	FLUKA	2860
Etherizer	Crafts		contenitore cilindrico in vetro con tappo in cotone
Bottiglia in vetro Bottiglie			da 250 ml Fiale
in vetro	Microtech	ST 10024	Tubo a fondo piatto 100 x 24
Frullatore a immersione Pimmy	Ariete		da cucina
Instant Lievito di successo	ESKA		Lievito in polvere
Vassoio di posa	Artigianato		vassoi in plexiglass (11 cm x 2,6 cm) in cui versare il terreno per la posa
Metil4-idrossibenzoato	SIGMA	H5501
Piastra di Petri	Falco	351016	60x5
Colorante rosso n. 40	SIGMA	16035
Stereomicroscopio con luci LED	Leica		S4E
Saccarosio	HIMEDIA	MB025
Salsa di pomodoro	Cirio

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