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Biochimica

Isolement des particules de lipoprotéine du jaune d'oeuf de poulet pour l'étude de l'incorporation d'acide gras de pathogène bactérien dans les phospholipides de membrane

Published: May 15, 2019
doi:
10.3791/59538
, ,
1Department of Microbiology and Molecular Genetics,Michigan State University, 2Department of Physiology,Michigan State University

Summary

Cette méthode fournit un cadre pour étudier l’incorporation des acides gras exogènes des sources hôtes complexes dans les membranes bactériennes, en particulier Staphylococcus aureus. Pour ce faire, des protocoles pour l’enrichissement des particules de lipoprotéines du jaune d’oeuf de poulet et le profilage suivant d’acide gras des phospholipides bactériens utilisant la spectrométrie de masse sont décrits.

Abstract

Staphylococcus aureus et d’autres pathogènes Gram-positifs incorporent les acides gras de l’environnement dans les phospholipides membranaires. Pendant l’infection, la majorité des acides gras exogènes sont présents dans les particules de lipoprotéines hôtes. L’incertitude demeure quant aux réservoirs d’acides gras hôtes et aux mécanismes par lesquels les bactéries extraient les acides gras des particules de lipoprotéines. Dans ce travail, nous décrivons des protocoles pour l’enrichissement des particules de lipoprotéine de basse densité (LDL) du jaune d’oeuf de poulet et de déterminer si les LDL servent de réservoirs d’acide gras pour S. aureus. Cette méthode exploite l’analyse lipidomique impartiale et les LDL de poulet, un modèle efficace et économique pour l’exploration des interactions entre les LDL et les bactéries. L’analyse de l’intégration de S. aureus des acides gras exogènes des LDL est effectuée en utilisant la spectrométrie de masse à haute résolution/précise et la spectrométrie de masse en tandem, permettant la caractérisation de la composition en acides gras de la bactérie membrane et identification impartiale de nouvelles combinaisons d’acides gras qui surgissent dans les lipides de membrane bactérienne lors de l’exposition aux LDL. Ces techniques avancées de spectrométrie de masse offrent une perspective inégalée de l’incorporation d’acides gras en révélant les acides gras exogènes spécifiques incorporés dans les phospholipides. Les méthodes décrites ici sont adaptables à l’étude d’autres agents pathogènes bactériens et de sources alternatives d’acides gras complexes.

Introduction

Le S. aureus résistant à la méthicilline (SARM) est la principale cause d’infection associée aux soins de santé et la résistance aux antibiotiques associée est un défi clinique considérable1,2,3. Par conséquent, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques est une grande priorité. Une stratégie de traitement prometteuse pour les pathogènes Gram-positifs inhibe la synthèse des acides gras, une exigence pour la production de phospholipide membranaire qui, dans S. aureus, comprend le phosphatidylglycérol (PG), lysyl-PG, et la cardiolipine4. Dans les bactéries, la production d’acides gras se produit par l’intermédiaire de la voie de synthèse d’acide gras II (FASII)5, qui est considérablement différente de la contrepartie eucaryotique, faisant FASII une cible attrayante pour le développement d’antibiotiques5,6 . Les inhibiteurs de FASII ciblent principalement FabI, une enzyme requise pour l’allongement de la chaîne de carbone d’acide gras7. Le triclosan inhibiteur FabI est largement utilisé dans les biens de consommation et médicaux8,9. D’autres inhibiteurs FabI sont en cours de développement par plusieurs sociétés pharmaceutiques pour le traitement de l’infection S. aureus 10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Cependant, beaucoup d’agents pathogènes Gram-positifs, y compris S. aureus,sont capables de récupérer les acides gras exogènes pour la synthèse phospholipide, en contournant l’inhibition FASII27,28,29. Ainsi, le potentiel clinique des inhibiteurs FASII est débattu en raison de lacunes considérables dans notre connaissance des sources d’acides gras hôtes et les mécanismes par lesquels les agents pathogènes extraient les acides gras de l’hôte27,28. Pour combler ces lacunes, nous avons développé une méthode d’analyse lipidomique impartiale pour surveiller l’incorporation d’acide gras exogène des particules de lipoprotéines dans les phospholipides membranaires de S. aureus.

Pendant la septicémie, les particules de lipoprotéines hôtes représentent une source potentielle d’acides gras dérivés de l’hôte dans la vascularisation, car la majorité des acides gras hôtes sont associés aux particules30. Les lipoprotéines se composent d’une coquille hydrophile composée de phospholipides et de protéines qui renferment un noyau hydrophobe de triglycérides et d’esters de cholestérol31. Quatre grandes classes de lipoprotéines – chylomicron, lipoprotéines de très faible densité, lipoprotéines de haute densité et lipoprotéines de faible densité (LDL) – sont produites par l’hôte et fonctionnent comme des véhicules de transport lipidiques, livrant des acides gras et du cholestérol à et à partir cellules hôtes par la vascularisation. Les LDL sont abondants en acides gras estérifiés, y compris les triglycérides et les esters de cholestérol31. Nous avons précédemment démontré que les LDL humains fortement purifiés sont une source viable d’acides gras exogènes pour la synthèse de PG, fournissant ainsi un mécanisme pour le contournement d’inhibiteur de FASII32. La purification des LDL humaines peut être techniquement difficile et prendre beaucoup de temps, tandis que les sources commerciales de LDL humains purifiés sont prohibitivement coûteuses à utiliser de façon routinière ou à effectuer des écrans bactériens à grande échelle. Pour remédier à ces limitations, nous avons modifié une procédure d’enrichissement des LDL à partir du jaune d’œuf de poulet, une riche source de particules de lipoprotéines33. Nous avons utilisé avec succès une spectrométrie de masse non ciblée et à haute résolution/précise et une spectrométrie de masse en tandem pour surveiller l’incorporation d’acides gras humains dérivés du LDL dans la membrane de S. aureus32. Contrairement aux méthodes précédemment signalées, cette approche peut quantifier les isoreurs individuels d’acides gras pour chacun des trois principaux types de phospholipides staphylococciques. L’acide oleique (18:1) est un acide gras insaturé présent dans toutes les particules de lipoprotéines hôtes qui est facilement incorporé e dans les phospholipides de S. aureus 29,30,32. S. aureus n’est pas capable de synthèse d’acide oléique29; par conséquent, la quantité d’acide oléique incorporé au phospholipide établit la présence d’acides gras diipoprotéines dans la membrane staphylococcique29. Ces espèces de phospholipides peuvent être identifiées par la méthode de spectrométrie de masse de pointe décrite ici, offrant une résolution sans précédent de la composition membranaire de S. aureus cultivé en présence d’une source d’acides gras qu’il est probable rencontres pendant l’infection.

Protocol

REMARQUE: Le protocole suivant pour l’enrichissement des particules lDL à partir du jaune d’œuf de poulet est dérivé de Moussa et al. 200233. 1. Préparation du jaune d’œuf de poulet pour l’enrichissement des particules de LDL Assainissez deux gros œufs de poulet en lavant les coquilles avec une solution d’éthanol à 70 % et laissez sécher à l’air. Assainiz le séparateur d’œufs à l’aide d’une solution d’éthanol à 70 % et laissez sécher…

Representative Results

Le protocole d’enrichissement du LDL à partir du jaune d’œuf de poulet est illustré à la figure 1. Ce processus commence par la dilution du jaune d’œuf entier avec salin et la séparation des solides jaune d’œuf appelés granules de la fraction soluble ou plasma contenant les LDL (Figure 1)33. La teneur en LDL de la fraction plasmatique est encore enrichie par la précipitation de la 30-40 kDa -livet…

Discussion

S. aureus intègre des acides gras exogènes dans sa membrane phospholipides27,32,43. La synthèse phospholipide utilisant des acides gras exogènes contourne l’inhibition faSII mais modifie également les propriétés biophysiques de la membrane27,32,44. Bien que l’incorporation d’acides gras exogènes dans les phospholipides …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions les membres du laboratoire Hammer pour leur évaluation critique du manuscrit et leur soutien à ce travail. Dr Alex Horswill de l’Université du Colorado School of Medicine aimablement fourni AH1263. Le laboratoire du Dr Chris Waters de l’Université d’État du Michigan a fourni des réactifs. Ce travail a été soutenu par l’American Heart Association subvention 16SDG30170026 et les fonds de démarrage fournis par l’Université d’État du Michigan.

Materials

Ammonium sulfate Fisher BP212R-1 ≥99.5% pure
Cell culture incubator Thermo MaxQ 6000
Centrafuge Thermo 75-217-420 Sorvall Legen XTR, rotor F14-6×250 LE
Costar assay plate Corning 3788 96 well
Filter paper Schleicher & Schuell 597
Large chicken egg N/A N/A Common store bought egg
Microplate spectrophotometer BioTek Epoch 2
NaCl Sigma S9625
S. aureus strain AH1263 N/A N/A Provided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubing Pierce 68700 7,000 MWCO
Tryptone Becton, Dickison and Company 211705
0.5 mm zirconium oxide beads Next Advance ZROB05
Bullet Blender Next Advance BBX24B
Methanol (LC-MS grade) Fisher A4561
Chloroform (reagent grade) Fisher MCX10559
Isopropanol (LC-MS grade) Fisher A4611
Dimyristoyl phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850345C-25mg
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 ≥99.5% pure
Ammonium formate Sigma 70221-25G-F
Xcalibur software Thermo Scientific OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Scientific high resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLC Agilent
SpeedVac Vacuum Concentrators Thermo Scientific
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Delekta, P. C., Lydic, T. A., Hammer, N. D. Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids. J. Vis. Exp. (147), e59538, doi:10.3791/59538 (2019).
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