L'obiettivo di questo protocollo è quello di genottare l'anemone di mare Nematostella vectensis durante la gastrulation senza sacrificare l'embrione.
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Articolo metodologico
Genotipizzazione dell'Anemone marino durante lo sviluppo precoce
In questo articolo
Sommario
Abstract
Descritto qui è un protocollo basato su PCR per genotipare l'embrione dello stadio gastrula del cnidariano anthozoano Nematostella vectensis senza sacrificare la vita dell'animale. Dopo la fecondazione in vitro e la de-jellying, gli zigoti sono autorizzati a svilupparsi per 24 h a temperatura ambiente per raggiungere la fase iniziale-medio gastrula. Gli embrioni di gastrula vengono poi posti su un letto di gel di agarose in un piatto Petri contenente acqua di mare. Al microscopio dissezioso, un ago di tungsteno viene utilizzato per separare chirurgicamente un frammento di tessuto aborale da ogni embrione. Gli embrioni post-chirurgia sono poi autorizzati a guarire e continuare lo sviluppo. Il DNA genomico viene estratto dal frammento di tessuto isolato e utilizzato come modello per la PCR specifica per il locus. Il genotipo può essere determinato in base alle dimensioni dei prodotti PCR o alla presenza/assenza di prodotti PCR specifici per alleli. Gli embrioni post-chirurgia vengono poi ordinati in base al genotipo. La durata dell'intero processo di genotipizzazione dipende dal numero di embrioni da vagliare, ma richiede minimamente 4-5 h. Questo metodo può essere utilizzato per identificare i mutanti knockout provenienti da una popolazione geneticamente eterogenea di embrioni e consente l'analisi dei fenotipi durante lo sviluppo.
Introduzione
I cnidariani rappresentano un gruppo eterogeneo di animali che includono meduse, coralli e anemoni di mare. Sono diploblasti, composti da ectodermi ed endodermi separati da una matrice extracellulare (mesoglea). Cnidaria è un gruppo gemello per speciosiare Bilateria, a cui i modelli animali tradizionali come Drosophila e Mus appartengono1. Inoltre, si pensa che la divergenza di Cnidaria-Bilateria si sia verificata nel periodo pre-Cambriano2. Come tale, gli studi comparativi di cnidariani e bilateriani sono essenziali per ottenere informazioni sulla biologia del loro antenato comune più recente. Recentem....
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Protocollo
1. Induzione della deposizione delle uova, fecondazione in vitro e deduzione
- Mantenere la veturi di Nematostella nell'acqua di mare con una salinità di 12 parti per mille (ppt) al buio a 16 gradi centigradi, alimentando Artemia ogni giorno.
- Il giorno prima dell'induzione della deposizione delle uova, posizionare gli animali in un'incubatrice a temperatura e a luce. Programmare l'incubatrice in modo che gli animali siano esposti a 8 h di luce a 25 gradi centigradi. Facoltativo: alimentare un piccolo pezzo (<1 mm3) di ostrica ai singoli animali prima di inserirli nell'incubatrice per migliorare la deposizione del....
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Risultati
Il genoma di Nematostella ha un singolo locus che codifica una proteina precursore per il neuropeptide GLWamide. Tre alleli mutanti knockout in questo locus (glw-a, glw-be glw-c) sono stati precedentemente segnalati5. Quattro maschi eterozigoli che trasportavano un allele di tipo selvaggio ( ) e l'allele da urlo glw-cal locus GLWamide (genotipo: / glw-c) sono stati i.......
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Discussione
Descritto qui un protocollo basato su PCR per genotipare un singolo embrione di anemone di mare senza sacrificare l'animale. Dopo la deposizione delle uova e la de-jellying, le uova fecondate sono autorizzate a svilupparsi in gastrulae. La regione aborale di ogni embrione di gastrula viene rimossa chirurgicamente e il tessuto aborale isolato viene utilizzato per la successiva estrazione genomica del DNA, mentre i restanti embrioni post-chirurgia guariscono e continuano lo sviluppo. Gli estratti di gDNA vengono quindi uti.......
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Dichiarazioni
L'autore non ha nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo i revisori anonimi per i commenti sulla versione precedente del manoscritto, che ha migliorato il manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi dell'Università dell'Arkansas.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Drosophila Peltier incubatrice refrigerata | Shellab | SRI6PF | Utilizzato per l'induzione della deposizione delle uova |
| Sale marino istantaneo dell'oceano | Oceano istantaneo | 138510 | |
| Cisti di gamberetti in salamoia | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-cisteina cloridrato | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Agitatore orbitale standard, modello 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITÀ BIOLOGICA | 351-007-01 | |
| Cloruro di potassio | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0,5 M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Sostituto | US Biological | N3500 | |
| Proteinasi K soluzione (20 mg/mL), RNA grado | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarosio | VWR | 710 | |
| Micro Porta aghi da dissezione | Roboz | RS-6060 | |
| Ago da dissezione in tungsteno | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Termociclatori | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide primer universale in avanti | 5'- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3' | ||
| Innesco inverso specifico per glw-a | 5'-CCAGATGCCTGGTGATAC-3' | ||
| Innesco inverso specifico per glw-c | 5'- CGGCCGGCGCATATATAG-3' |
Riferimenti
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al.
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Ristampe e permessi
