São apresentados métodos para preparar e caracterizar as propriedades físico-químicas e a bioatividade de nanopartículas de siRNA com carga neutra e pH responsivo. Os critérios para nanomedicinas bem sucedidas de siRNA tais como o tamanho, a morfologia, a carga de superfície, o carregamento de siRNA, e o silenciamento do gene são discutidos.
O sucesso de siRNA como uma medicina molecular alvejada é dependente em cima de sua entrega citosólica eficiente às pilhas dentro do tecido da patologia. O sucesso clínico para tratar previamente “undruggable” alvos hepatic da doença com siRNA foi conseguido. Entretanto, a entrega eficiente do siRNA do tumor necessita considerações farmacocinéticas adicionais do projeto, incluindo o tempo longo da circulação, a evasão de órgãos do afastamento (por exemplo, fígado e rins), e a penetração e a retenção do tumor. Aqui, nós descrevemos a preparação e in vitro caracterização físico-química/biológica de nanopartículas poliméricos projetadas para a entrega eficiente de siRNA, particular aos tecidos não-hepatic tais como tumores. As nanopartículas de siRNA são preparadas por complexação eletrostática de siRNA e o copolímero diblock poli (etileno glicol-b-[2-(dimetilamino) etil metacrilato-co-butil metacrilato]) (PEG-DB) para formar complexos de poliíons ( polyplexes) onde o siRNA é seqüestrado dentro do núcleo do Polyplex e o Peg dá forma a uma Corona hidrófila, neutrally-carregada. Além disso, o bloco do DB transforma-se membrana-Lytic como os vesículas da via endolysosomal acidificar (< pH 6,8), provocando o escape endossomal e a entrega citosólica de siRNA. Métodos para caracterizar as características físico-químicas de nanopartículas de siRNA como tamanho, carga superficial, morfologia de partículas e carregamento de siRNA são descritos. A bioatividade de nanopartículas de siRNA é medida usando a luciferase como um gene modelo em um ensaio de silenciamento gênico rápido e de alta taxa de transferência. Os projetos que passam estes testes iniciais (tais como polyplexes PEG-DB-baseados) são considerados apropriados para a tradução aos estudos animais pré-clínicos que avaliam a entrega de siRNA aos tumores ou aos outros locais da patologia.
Como as siRNAs inibem a tradução de proteínas de seqüências de mRNA, teoricamente podem ser usadas para drogas todas as patologias conhecidas1,2,3,4,5. No entanto, o uso de siRNA em medicina é limitado pelo perfil farmacocinético exaustivamente pobre de moléculas de siRNA6,7. Quando injetadas intravenosamente, as siRNAs são rapidamente desmarcadas através dos rins e/ou degradadas por nucleases8,9. Devido ao seu grande tamanho e carga negativa, o siRNA não pode entrar em células ou escapar da via endolysosomal para acessar o complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) que reside no citosol10,11,12, treze anos. Assim, o amplo esforço tem focado no desenho e implementação das estratégias de entrega do siRNA14. Este esforço concentrou-se em grande parte no desenvolvimento de nanopartículas baseadas em lipídios e polímeros que empacotem siRNA, protegem-na do afastamento e da degradação in vivo, e iniciam a captação celular e o escape endossomal através dos grupos ionizable, catiônicos da amina. Muitos sucessos pré-clínicos foram relatados e mais recentemente, o primeiro sucesso clínico foi relatado para a entrega hepatic Nanoparticle-baseada do siRNA para tratar o amiloidose transthyretin-negociado hereditário (hattr)15.
Há muitos genes causadores de câncer que são atualmente “undruggable” pela farmacologia convencional (ou seja, pequenas moléculas de drogas), motivando o projeto de nanopartículas de siRNA poliméricos (si-NPs) para tratar o câncer16. No entanto, há um conjunto separado de parâmetros de projeto que devem ser considerados para a entrega de siRNA não-hepática. O sistema de distribuição deve proteger a carga catiônica do poliplex que provoca aglutinação dentro da circulação sistêmica17,18,19. Para a entrega do tumor, especificamente, a estabilidade do si-NP é essencial para dotar a circulação longa e assim a acumulação aumentada dentro dos tumores através do efeito realçado da permeabilidade e da retenção (EPR)20,21. Além disso, o controle sobre o tamanho de si-NP é essencial, uma vez que apenas nanopartículas de aproximadamente 20 – 200 nm de diâmetro na alavancagem de tamanho EPR22, e menor si-NPS (~ 20 – 50 nm de diâmetro) exibem melhor penetração tumoral sobre nanopartículas de tamanho maior e micropartículas23.
Para abordar estas limitações adicionais do projeto para a entrega sistemática do tumor de siRNA depois da administração intravenosa, neutralmente-carregada, si-NPs pH-responsivo foi desenvolvida (Figura 1)24. Estes si-NPs são PEGylated, ou mais recentemente, Zwitterionated25, para a carga de superfície neutra e a resistência à adsorção e à opsonização da proteína na circulação. Desde que não podem depender unicamente do caráter catiônico para conduzir a entrega intracelular, o escape endossomal extremamente eficiente é imperativo para conseguir o silenciamento de gene potente. Consequentemente, o núcleo destes si-NPS é compor de um núcleo altamente endosomolytic que seja inerte no pH extracelular (7,4), mas que é provocado em um interruptor-como a maneira nas condições acidificado da via endolysosomal [pH 6,8 (endosomes adiantados) – 5,0 ( lisossomas)]. Por último, uma mistura de conteúdo catiônico e hidrofóbico dentro do núcleo do si-NPs fornecer forças de estabilização eletrostática e Van der Waals, melhorando a estabilidade do si-NPs no sangue em comparação com sistemas meramente catiônicos.
A integração de muitas funções em um projeto relativamente simples é possível usando a polimerização controlada de transferência de cadeia de adição-fragmentação reversível (RAFT) para produzir polímeros com arquitetura complexa e composição precisa. Para produzir si-NPs com carga de superfície neutra, pH-responsividade e estabilidade NP, a JANGADA é usada para sintetizar poli (etileno glicol-b-[2-(dimetilamino) metacrilato de etilo-co-butil metacrilato]) (PEG-DB; Figura 1a). O PEG-DB é complexado eletrostaticamente com siRNA, formando si-NPs com uma Corona PEG e núcleo DB/siRNA (Figura 1b). O PEG forma uma camada hidrófila inerte, neutralmente carregada na Corona do si-NP. O bloco DB consiste em uma razão molar de 50:50 de 2-(dimetilamino) de metacrilato de etilo (DMAEMA) e metacrilato de butilo (BMA). Complexos eletrostaticamente catiônicos de DMAEMA com carga negativa de siRNA. BMA Self-Associates dentro do núcleo NP por interações Van der Waals, aumentando a estabilidade NP. Em conjunto, DMAEMA e BMA concebem o comportamento lítico lipídico dependente do pH para o bloco de polímero DB. No pH extracelular, o bloco DB é sequestrado para o núcleo si-NP e é inerte a bilayers lipídicos. condições ácidas, como aquelas dentro da via endolysosomal, a DMAEMA ionizável dentro do bloco DB facilita o efeito da esponja de prótons, onde a tamponamento endossômica leva ao inchaço e ruptura osmótica26. Adicionalmente, os metades hydrofóbicos do BMA dentro do bloco do DB integram ativamente em e lyse bilayers lipídicos, tendo por resultado o endosomolysis potente. Assim, o siRNA é complexado com Peg-DB para formar si-NPS que são neutralmente carregados e altamente estáveis no pH extracelular, mas que perturbam as bicamadas lipídicas no pH ácido, assegurando a entrega citosónica do Payload siRNA.
São descritos aqui os procedimentos experimentais para produzir si-NPs de PEG-DB. Os métodos para caracterizar os parâmetros físico-químicos e a bioatividade de si-NPs são apresentados e discutidos. A fim de avaliar rapidamente a bioatividade de si-NP, a luciferase é usada como um gene modelo para estudos de knockdown. Firefly luciferase é a proteína responsável pelo ‘ fulgor ‘ dos vaga-lumes27. Assim, as células de mamíferos transfectadas com o gene da luciferase do vagalume produzem um “brilho” bioluminescente que pode ser capturado usando um luminômetro para quantificar os níveis de expressão de luciferase. Aqui, usamos luciferase para avaliar a bioatividade de si-NPs, entregando siRNA contra luciferase e quantificando a redução correspondente em bioluminescência em células expressando luciferase em comparação com células que recebem um siRNA mexido.
Os si-NPs descritos aqui são formados por associação eletrostática de siRNA aniônica e Polímeros Catiônicos em complexos de poliion (polyplexes). A complexação eletrostática de siRNA e o bloco catiônicos DB de polímeros Peg-DB são facilitadas pela mistura a baixo pH (4,0). No pH 4,0, o DMAEMA é altamente protonado e, consequentemente, o bloco DB é altamente carregado. Isto assegura-se de que os polímeros se dissolvem como unimers na solução ao contrário de formar micelas e que complexos do DB eficiente…
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem aos Drs. Craig Duvall e Rebecca Cook pelo acesso a dados e recursos laboratoriais para a realização desta pesquisa. Os autores são gratos ao Instituto Vanderbilt para a nanoescala de ciência e engenharia (VINSE) para o acesso a DLS e TEM (NSF EPS 1004083) instrumentos. Os autores são gratos à Fundação Nacional de ciência para apoiar o programa de bolsas de pós-graduação em pesquisa (NSF # 1445197). Os autores agradecem aos institutos nacionais de saúde pelo apoio financeiro (NIH R01 EB019409). Os autores são gratos ao departamento de defesa Congressionally dirigido programa de pesquisa médica para apoio financeiro (DOD CDMRP OR130302).
0.45 mm pore-size syringe filters | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm diameter, PTFE membrane |
0-14 pH test strips | Millipore Sigma | P4786 | |
10x TAE buffer | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
6-7.7 pH test strips | Millipore Sigma | P3536 | |
96-well black walled plates | Corning | 3603 | Tissue-culture treated |
Agarose Powder | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | |
Citric acid monohydrate | Millipore Sigma | C1909 | |
dibasic sodium phosphate dihydrate | Millipore Sigma | 71643 | |
D-luciferin | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Monopotassium Salt |
DMEM | Gibco | 11995065 | High glucose and pyruvate |
Ethanol | Millipore Sigma | 459836 | |
ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
FBS | Gibco | 26140079 | |
loading dye | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
Luciferase siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases |
MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity |
monobasic sodium phosphate monohydrate | Millipore Sigma | S9638 | |
Scarmbled siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases |
square polystyrene cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | 4.5 mL capacity |
TEM grids | Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper |
Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804 | |
uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 |