Summary

Preparação de nanopartículas poliméricos neutralmente carregadas e responsivas ao pH para entrega de siRNA citosólica

Published: May 02, 2019
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Summary

São apresentados métodos para preparar e caracterizar as propriedades físico-químicas e a bioatividade de nanopartículas de siRNA com carga neutra e pH responsivo. Os critérios para nanomedicinas bem sucedidas de siRNA tais como o tamanho, a morfologia, a carga de superfície, o carregamento de siRNA, e o silenciamento do gene são discutidos.

Abstract

O sucesso de siRNA como uma medicina molecular alvejada é dependente em cima de sua entrega citosólica eficiente às pilhas dentro do tecido da patologia. O sucesso clínico para tratar previamente “undruggable” alvos hepatic da doença com siRNA foi conseguido. Entretanto, a entrega eficiente do siRNA do tumor necessita considerações farmacocinéticas adicionais do projeto, incluindo o tempo longo da circulação, a evasão de órgãos do afastamento (por exemplo, fígado e rins), e a penetração e a retenção do tumor. Aqui, nós descrevemos a preparação e in vitro caracterização físico-química/biológica de nanopartículas poliméricos projetadas para a entrega eficiente de siRNA, particular aos tecidos não-hepatic tais como tumores. As nanopartículas de siRNA são preparadas por complexação eletrostática de siRNA e o copolímero diblock poli (etileno glicol-b-[2-(dimetilamino) etil metacrilato-co-butil metacrilato]) (PEG-DB) para formar complexos de poliíons ( polyplexes) onde o siRNA é seqüestrado dentro do núcleo do Polyplex e o Peg dá forma a uma Corona hidrófila, neutrally-carregada. Além disso, o bloco do DB transforma-se membrana-Lytic como os vesículas da via endolysosomal acidificar (< pH 6,8), provocando o escape endossomal e a entrega citosólica de siRNA. Métodos para caracterizar as características físico-químicas de nanopartículas de siRNA como tamanho, carga superficial, morfologia de partículas e carregamento de siRNA são descritos. A bioatividade de nanopartículas de siRNA é medida usando a luciferase como um gene modelo em um ensaio de silenciamento gênico rápido e de alta taxa de transferência. Os projetos que passam estes testes iniciais (tais como polyplexes PEG-DB-baseados) são considerados apropriados para a tradução aos estudos animais pré-clínicos que avaliam a entrega de siRNA aos tumores ou aos outros locais da patologia.

Introduction

Como as siRNAs inibem a tradução de proteínas de seqüências de mRNA, teoricamente podem ser usadas para drogas todas as patologias conhecidas1,2,3,4,5. No entanto, o uso de siRNA em medicina é limitado pelo perfil farmacocinético exaustivamente pobre de moléculas de siRNA6,7. Quando injetadas intravenosamente, as siRNAs são rapidamente desmarcadas através dos rins e/ou degradadas por nucleases8,9. Devido ao seu grande tamanho e carga negativa, o siRNA não pode entrar em células ou escapar da via endolysosomal para acessar o complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) que reside no citosol10,11,12, treze anos. Assim, o amplo esforço tem focado no desenho e implementação das estratégias de entrega do siRNA14. Este esforço concentrou-se em grande parte no desenvolvimento de nanopartículas baseadas em lipídios e polímeros que empacotem siRNA, protegem-na do afastamento e da degradação in vivo, e iniciam a captação celular e o escape endossomal através dos grupos ionizable, catiônicos da amina. Muitos sucessos pré-clínicos foram relatados e mais recentemente, o primeiro sucesso clínico foi relatado para a entrega hepatic Nanoparticle-baseada do siRNA para tratar o amiloidose transthyretin-negociado hereditário (hattr)15.

Há muitos genes causadores de câncer que são atualmente “undruggable” pela farmacologia convencional (ou seja, pequenas moléculas de drogas), motivando o projeto de nanopartículas de siRNA poliméricos (si-NPs) para tratar o câncer16. No entanto, há um conjunto separado de parâmetros de projeto que devem ser considerados para a entrega de siRNA não-hepática. O sistema de distribuição deve proteger a carga catiônica do poliplex que provoca aglutinação dentro da circulação sistêmica17,18,19. Para a entrega do tumor, especificamente, a estabilidade do si-NP é essencial para dotar a circulação longa e assim a acumulação aumentada dentro dos tumores através do efeito realçado da permeabilidade e da retenção (EPR)20,21. Além disso, o controle sobre o tamanho de si-NP é essencial, uma vez que apenas nanopartículas de aproximadamente 20 – 200 nm de diâmetro na alavancagem de tamanho EPR22, e menor si-NPS (~ 20 – 50 nm de diâmetro) exibem melhor penetração tumoral sobre nanopartículas de tamanho maior e micropartículas23.

Para abordar estas limitações adicionais do projeto para a entrega sistemática do tumor de siRNA depois da administração intravenosa, neutralmente-carregada, si-NPs pH-responsivo foi desenvolvida (Figura 1)24. Estes si-NPs são PEGylated, ou mais recentemente, Zwitterionated25, para a carga de superfície neutra e a resistência à adsorção e à opsonização da proteína na circulação. Desde que não podem depender unicamente do caráter catiônico para conduzir a entrega intracelular, o escape endossomal extremamente eficiente é imperativo para conseguir o silenciamento de gene potente. Consequentemente, o núcleo destes si-NPS é compor de um núcleo altamente endosomolytic que seja inerte no pH extracelular (7,4), mas que é provocado em um interruptor-como a maneira nas condições acidificado da via endolysosomal [pH 6,8 (endosomes adiantados) – 5,0 ( lisossomas)]. Por último, uma mistura de conteúdo catiônico e hidrofóbico dentro do núcleo do si-NPs fornecer forças de estabilização eletrostática e Van der Waals, melhorando a estabilidade do si-NPs no sangue em comparação com sistemas meramente catiônicos.

A integração de muitas funções em um projeto relativamente simples é possível usando a polimerização controlada de transferência de cadeia de adição-fragmentação reversível (RAFT) para produzir polímeros com arquitetura complexa e composição precisa. Para produzir si-NPs com carga de superfície neutra, pH-responsividade e estabilidade NP, a JANGADA é usada para sintetizar poli (etileno glicol-b-[2-(dimetilamino) metacrilato de etilo-co-butil metacrilato]) (PEG-DB; Figura 1a). O PEG-DB é complexado eletrostaticamente com siRNA, formando si-NPs com uma Corona PEG e núcleo DB/siRNA (Figura 1b). O PEG forma uma camada hidrófila inerte, neutralmente carregada na Corona do si-NP. O bloco DB consiste em uma razão molar de 50:50 de 2-(dimetilamino) de metacrilato de etilo (DMAEMA) e metacrilato de butilo (BMA). Complexos eletrostaticamente catiônicos de DMAEMA com carga negativa de siRNA. BMA Self-Associates dentro do núcleo NP por interações Van der Waals, aumentando a estabilidade NP. Em conjunto, DMAEMA e BMA concebem o comportamento lítico lipídico dependente do pH para o bloco de polímero DB. No pH extracelular, o bloco DB é sequestrado para o núcleo si-NP e é inerte a bilayers lipídicos. condições ácidas, como aquelas dentro da via endolysosomal, a DMAEMA ionizável dentro do bloco DB facilita o efeito da esponja de prótons, onde a tamponamento endossômica leva ao inchaço e ruptura osmótica26. Adicionalmente, os metades hydrofóbicos do BMA dentro do bloco do DB integram ativamente em e lyse bilayers lipídicos, tendo por resultado o endosomolysis potente. Assim, o siRNA é complexado com Peg-DB para formar si-NPS que são neutralmente carregados e altamente estáveis no pH extracelular, mas que perturbam as bicamadas lipídicas no pH ácido, assegurando a entrega citosónica do Payload siRNA.

São descritos aqui os procedimentos experimentais para produzir si-NPs de PEG-DB. Os métodos para caracterizar os parâmetros físico-químicos e a bioatividade de si-NPs são apresentados e discutidos. A fim de avaliar rapidamente a bioatividade de si-NP, a luciferase é usada como um gene modelo para estudos de knockdown. Firefly luciferase é a proteína responsável pelo ‘ fulgor ‘ dos vaga-lumes27. Assim, as células de mamíferos transfectadas com o gene da luciferase do vagalume produzem um “brilho” bioluminescente que pode ser capturado usando um luminômetro para quantificar os níveis de expressão de luciferase. Aqui, usamos luciferase para avaliar a bioatividade de si-NPs, entregando siRNA contra luciferase e quantificando a redução correspondente em bioluminescência em células expressando luciferase em comparação com células que recebem um siRNA mexido.

Protocol

1. preparação e caracterização de si-NPs preparação para si-NP Dissolva o polímero em tampão de ácido cítrico de 10 mM (pH 4,0) a 3,33 mg/mL. O polímero pode primeiramente ser dissolvido na concentração 10x no ethanol para assegurar a dissolução.Nota: o polímero pode ser dissolvido em concentrações mais baixas, mas o uso em concentrações acima de 3,33 mg/mL pode impedir a formação homogénea do NP. Adicionar siRNA (50 μM em diH2O) para resultar em N+…

Representative Results

Algumas características essenciais do si-NPs efetivo para a entrega in vivo de siRNA são o tamanho adequado (~ 20 – 200 nm de diâmetro), embalagem de siRNA e bioatividade de silenciamento de genes. Embora esta não seja uma lista exaustiva (como abordada na discussão), estas características básicas devem ser confirmadas antes de considerar mais testes de uma formulação. A Figura 2 ilustra …

Discussion

Os si-NPs descritos aqui são formados por associação eletrostática de siRNA aniônica e Polímeros Catiônicos em complexos de poliion (polyplexes). A complexação eletrostática de siRNA e o bloco catiônicos DB de polímeros Peg-DB são facilitadas pela mistura a baixo pH (4,0). No pH 4,0, o DMAEMA é altamente protonado e, consequentemente, o bloco DB é altamente carregado. Isto assegura-se de que os polímeros se dissolvem como unimers na solução ao contrário de formar micelas e que complexos do DB eficiente…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem aos Drs. Craig Duvall e Rebecca Cook pelo acesso a dados e recursos laboratoriais para a realização desta pesquisa. Os autores são gratos ao Instituto Vanderbilt para a nanoescala de ciência e engenharia (VINSE) para o acesso a DLS e TEM (NSF EPS 1004083) instrumentos. Os autores são gratos à Fundação Nacional de ciência para apoiar o programa de bolsas de pós-graduação em pesquisa (NSF # 1445197). Os autores agradecem aos institutos nacionais de saúde pelo apoio financeiro (NIH R01 EB019409). Os autores são gratos ao departamento de defesa Congressionally dirigido programa de pesquisa médica para apoio financeiro (DOD CDMRP OR130302).

Materials

0.45 mm pore-size syringe filters Thermo Fisher Scientific F25133 17 mm diameter, PTFE membrane
0-14 pH test strips Millipore Sigma P4786
10x TAE buffer Thermo Fisher Scientific/Invitrogen AM9869
6-7.7 pH test strips Millipore Sigma P3536
96-well black walled plates Corning 3603 Tissue-culture treated
Agarose Powder Thermo Fisher Scientific/Invitrogen 16500
Citric acid monohydrate Millipore Sigma C1909
dibasic sodium phosphate dihydrate Millipore Sigma 71643
D-luciferin Thermo Fisher Scientific 88294 Monopotassium Salt
DMEM Gibco 11995065 High glucose and pyruvate
Ethanol Millipore Sigma 459836
ethidium bromide Thermo Fisher Scientific/Invitrogen 15585011
FBS Gibco 26140079
loading dye Thermo Fisher Scientific/Invitrogen R0611
Luciferase siRNA IDT N/A Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases
MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells GenTarget Inc SC059-Bsd Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity
monobasic sodium phosphate monohydrate Millipore Sigma S9638
Scarmbled siRNA IDT N/A Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases
square polystyrene cuvettes Fisher Scientific 14-955-129 4.5 mL capacity
TEM grids Ted Pella, Inc. 1GC50 PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper
Trisodium citrate dihydrate Millipore Sigma S1804
uranyl acetate Polysciences, Inc. 21447-25

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Citazione di questo articolo
Hendershot, J., Smith, A. E., Werfel, T. A. Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery. J. Vis. Exp. (147), e59549, doi:10.3791/59549 (2019).

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