Metoder for å forberede og karakterisere fysikalsk egenskaper og bioactivity av nøytralt-ladet, pH-responsive siRNA nanopartikler er presentert. Kriterier for vellykkede siRNA-nanomedisiner som størrelse, morfologi, overflate ladning, siRNA-lasting og gendeaktivering diskuteres.
Suksessen til siRNA som en målrettet molekylær medisin er avhengig av sin effektive cytosolic levering til celler i vevet i patologi. Klinisk suksess for behandling av tidligere ‘ undruggable ‘ lever sykdoms mål med siRNA har blitt oppnådd. Men effektiv tumor siRNA levering nødvendiggjør ytterligere farmakokinetiske design hensyn, inkludert lang sirkulasjon tid, Evasion av klaring organer (f. eks, lever og nyrer), og tumor penetrasjon og oppbevaring. Her beskriver vi utarbeidelse og in vitro fysikalsk/biologisk karakterisering av polymer nanopartikler designet for effektiv siRNA levering, spesielt til ikke-hepatic vev som svulster. Den siRNA nanopartikler er utarbeidet av elektrostatisk kompleks av siRNA og diblokk kopolymer Poly (etylen glykol-b-[2-(dimetylamino) etanol akrylat-co-butyl AKRYLAT]) (PEG-DB) for å danne polyion komplekser ( polyplexes) der siRNA er sequestered innenfor polyplex kjernen og PEG danner en hydrofile, nøytralt-ladet Corona. Videre DB blokken blir membran-lytisk som blemmer av endolysosomal veien acidify (< pH 6,8), utløser endosomal rømme og cytosolic levering av siRNA. Metoder for å karakterisere de fysikalsk egenskapene til siRNA nanopartikler som størrelse, overflate ladning, partikkel morfologi og siRNA-lasting er beskrevet. Bioactivity av siRNA nanopartikler måles ved hjelp av luciferase som en modell gen i en rask og høy gjennomstrømming gen demping analysen. Tegninger hvilke admission card disse Initial prøver (som PEG-DB-basert polyplexes) er betraktet som passende for oversettelse å prekliniske dyr studier vurderingen leveringen av siRNA å svulst eller annet steder av patologi.
Fordi siRNAs hemme oversettelsen av proteiner fra mRNA sekvenser, kan de teoretisk brukes til narkotika alle kjente patologi1,2,3,4,5. Bruken av siRNA i medisin er imidlertid begrenset av den omfattende, fattige farmakokinetiske profilen til siRNA molekyler6,7. Når injisert intravenøst, siRNAs er raskt tømmes gjennom nyrene og/eller degradert av nukleaser8,9. På grunn av sin store størrelse og negative ladning, kan siRNA ikke gå inn i celler eller unnslippe endolysosomal veien for å få tilgang til RNA-indusert demping kompleks (RISC) som ligger i stoffer10,11,12, 13 i år. Dermed har omfattende innsats fokusert på design og implementering av siRNA leveranse strategier14. Dette arbeidet har i stor grad fokusert på utvikling av lipid-og polymer-baserte nanopartikler som pakke siRNA, beskytte den fra klarering og degradering in vivo, og initiere cellulær opptak og endosomal flykte gjennom ionebyttermembraner, kationiske Amin grupper. Mange pre-klinisk suksesser har blitt rapportert og sist, den første kliniske suksessen er rapportert for nanopartikkel-baserte hepatic siRNA levering til behandling arvelig transthyretin-mediert (hATTR) amyloidose15.
Det er mange kreftfremkallende gener som for tiden er “undruggable” av konvensjonelle farmakologi (dvs. små molekyl narkotika), motiverende utformingen av polymer siRNA nanopartikler (si-NPs) for å behandle kreft16. Det finnes imidlertid et eget sett med utformings parametere som må vurderes for ikke-hepatic siRNA-levering. Leveringssystemet må skjerme kationiske ladning av polyplex som forårsaker Agglutinasjon innenfor systemisk sirkulasjon17,18,19. For tumor levering, spesielt, si-np stabilitet er viktig å gi gave lang sirkulasjon og dermed økt akkumulering innen svulster via forbedret permeabilitet og oppbevaring (EPR) effekt20,21. Videre er kontroll over si-NP størrelse viktig siden bare nanopartikler ca 20-200 NM diameter i størrelse utnytte EPR22, og mindre si-NPs (~ 20-50 NM diameter) utstillingen forbedret tumor penetrasjon over større størrelser nanopartikler og mikropartikler23.
For å håndtere disse ekstra design begrensningene for systemisk tumor levering av siRNA etter intravenøs administrering, er det utviklet nøytralt pH-responsiv si-NPs (figur 1)24. Disse si-NPs er pegylert, eller sist, Zwitterionated25, for nøytral overflate ladning og resistens mot absorpsjon av protein og opsonization i sirkulasjon. Siden de ikke kan stole utelukkende på kationiske karakter for å kjøre intracellulære levering, er ekstremt effektiv endosomal å unnslippe avgjørende for å oppnå potent gen-deaktivering. Følgelig er kjernen i disse si-NPs består av en svært endosomolytic kjerne som er inert på ekstracellulære pH (7,4), men som utløses i en Switch-lignende måte i de surgjort forholdene i endolysosomal veien [pH 6,8 (tidlig endosomes)-5,0 ( lysosomer)]. Endelig, en blanding av kationiske og hydrofobe innhold i kjernen av si-NPs gir både elektrostatisk og Van der Waals stabilisering styrker, forbedre stabiliteten i si-NPs i blodet i forhold til bare kationiske systemer.
Integreringen av mange funksjoner i en relativt enkel design er mulig ved hjelp av reversibel tillegg-fragmentering kjeden Transfer (RAFT) kontrollerte polymerisering å produsere polymerer med kompleks arkitektur og presis sammensetning. Å produsere si-NPs med nøytral overflate ladning, pH-respons, og NP stabilitet, er FLÅTEN som brukes til å syntetisere Poly (etylen glykol-b-[2-(dimetylamino) etanol akrylat-co-butyl AKRYLAT]) (PEG-DB; Figur 1a). PEG-DB er elektrostatisk complexed med siRNA, forming si-NPs med en PEG Corona og DB/siRNA kjerne (figur 1B). PEG danner et inert, nøytralt hydrofile lag på si-NP Corona. DB-blokken består av en 50:50 molar ratio på 2-(dimetylamino) etanol akrylat (DMAEMA) og butyl akrylat (BMA). Kationiske DMAEMA elektrostatisk komplekser negativt ladet siRNA. BMA Self-Associates i NP-kjernen av van der Waals interaksjoner, økende NP stabilitet. Sammen, DMAEMA og BMA meddele pH-avhengig lipid bilayer-lytisk oppførsel til DB polymer blokk. Ved ekstracellulære pH er DB-blokken sequestered til si-NP-kjernen og er inert til lipid bilayers. Under Sure forhold, slik som de i endolysosomal veien, ionebyttermembraner DMAEMA innenfor DB blokken Letter Proton svamp effekt, der endosomal bufring fører til osmotisk hevelse og brudd26. I tillegg hydrofobe BMA andeler i DB-blokken aktivt integreres i og lyse lipid bilayers, noe som resulterer i potent endosomolysis. Således, siRNA er complexed med PEG-DB å blankett si-NPs det er nøytralt-ladet og høylig stabile for ekstracellulære pH bortsett fra hvilke avbryte lipid bilayers for syrlig pH, forsikrer cytosolic leveranse av det siRNA payload.
Heri beskrives de eksperimentelle prosedyrene for å produsere si-NPs fra PEG-DB. Metoder for å karakterisere fysikalsk parametre og bioactivity av si-NPs er presentert og diskutert. For å raskt kunne vurdere si-NP-bioactivity, brukes luciferase som modell gen for knockdown studier. Firefly luciferase er proteinet som er ansvarlig for “gløden” av ildfluene27. Følgelig, pattedyrceller transfekterte med Firefly luciferase genet produsere en Puerto Mosquito “glød” som kan fanges opp ved hjelp av en luminometeret å kvantifisere nivåer av luciferase uttrykk. Her bruker vi luciferase å vurdere bioactivity av si-NPs ved å levere siRNA mot luciferase og kvantifisere tilsvarende reduksjon i bioluminesens i luciferase-uttrykker celler i forhold til celler som mottar en forvrengt siRNA.
Si-NPs beskrevet her er dannet av elektrostatisk sammenslutning av anioniske siRNA og kationiske polymerer i polyion komplekser (polyplexes). Elektrostatisk kompleks av siRNA og kationiske DB blokk av PEG-DB polymerer er tilrettelagt ved å blande ved lav pH (4,0). Ved pH 4,0, er DMAEMA svært protonerte, og følgelig DB blokken er svært ladet. Dette sikrer at polymerer oppløses som unimers i løsning i motsetning til forming miceller og at DB komplekser effektivt med siRNA. Deretter justeres pH-verdien til nøytral (p…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er takknemlige for DRS. Craig Duvall og Rebecca Cook for tilgang til data og laboratorie ressurser for å gjennomføre denne forskningen. Forfatterne er takknemlige for Vanderbilt Institute for nanoskala Science and Engineering (VINSE) for tilgang til DLS og TEM (NSF EPS 1004083) instrumenter. Forfatterne er takknemlige for National Science Foundation for å støtte Graduate Research Fellowship Program (NSF # 1445197). Forfatterne er takknemlige for National Institutes of Health for økonomisk støtte (NIH R01 EB019409). Forfatterne er takknemlige for Department of Defense Congressionally regissert Medical Research program for økonomisk støtte (DOD CDMRP OR130302).
0.45 mm pore-size syringe filters | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm diameter, PTFE membrane |
0-14 pH test strips | Millipore Sigma | P4786 | |
10x TAE buffer | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
6-7.7 pH test strips | Millipore Sigma | P3536 | |
96-well black walled plates | Corning | 3603 | Tissue-culture treated |
Agarose Powder | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | |
Citric acid monohydrate | Millipore Sigma | C1909 | |
dibasic sodium phosphate dihydrate | Millipore Sigma | 71643 | |
D-luciferin | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Monopotassium Salt |
DMEM | Gibco | 11995065 | High glucose and pyruvate |
Ethanol | Millipore Sigma | 459836 | |
ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
FBS | Gibco | 26140079 | |
loading dye | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
Luciferase siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases |
MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity |
monobasic sodium phosphate monohydrate | Millipore Sigma | S9638 | |
Scarmbled siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases |
square polystyrene cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | 4.5 mL capacity |
TEM grids | Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper |
Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804 | |
uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 |