Damlacık dijital tuzak (ddTRAP): telomere tekrar amplifikasyon protokolünün droplet dijital polimeraz zincir reaksiyonuna adaptasyon
Summary
Biz başarıyla standart telomer tekrar amplifikasyon Protokolü (Trap) tahlil damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonları istihdam edilecek dönüştürülür. Bu yeni tahlil, ddTRAP denilen, daha hassas ve niceliksel, daha iyi algılama ve çeşitli insan hücreleri içinde telomeraz aktivite istatistiksel analiz için izin.
Abstract
Telomer tekrar amplifikasyon Protokolü (TRAP), verilen bir örnek içinde telomeraz etkinliğini algılamak için en yaygın olarak kullanılan tahlil olduğunu. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı yöntem en hücre Lysates enzim aktivitesinin sağlam ölçümleri için izin verir. Floresan etiketli astar ile jel tabanlı TRAP örnek verimi sınırlar ve numuneler farklılıkları tespit yeteneği enzim aktivitesinde iki kat veya daha büyük değişiklikler ile sınırlıdır. Damlacık dijital tuzak, ddtrap, geleneksel Trap tahlil değiştirilmiş bir son derece hassas bir yaklaşımdır, kullanıcının çalıştırmak başına 96 örnekleri üzerinde sağlam bir analiz yapmak ve DNA mutlak kantifikasyon elde sağlayan (telomeraz uzatma ürünleri ) her PCR içinde giriş. Bu nedenle, yeni geliştirilen ddTRAP tahlil geleneksel jel tabanlı TRAP tahlil sınırlamaları üstesinden gelir ve laboratuar ve klinik ayarları içinde telomeraz etkinliğini ölçmek için daha verimli, doğru ve nicel bir yaklaşım sağlar.
Introduction
Telomerler Doğrusal kromozomların ucunda Dinamik DNA-protein kompleksler. İnsan telomerleri bir dizi oluşur 5 ‘-TTAGGGn hexameric tekrarlar arasında uzunluğu değişmektedir 12 – 15 kiloüsler (KB) Doğum1. İnsan telomeraz, telomerleri tutan Ribonükleoprotein enzim, ilk hela hücresi endoglikozidazları (kanser hücresi hattı)2tespit edildi. Birlikte, telomerler ve telomeraz genom koruması, gen düzenlemesi ve kanser hücresi ölümsüzlüğü3,4,5,6gibi biyolojik süreçlerin bir spektrumunda önemli bir rol oynamaktadır.
İnsan telomeraz öncelikle iki anahtar bileşenden oluşur, yani telomeraz ters transkriptaz ve telomeraz RNA (hTERT ve hterc, sırasıyla). Protein subunit, hTERT, telomeraz enziminin katalytik olarak aktif ters transcriptaz bileşenidir. RNA şablonu olan hTERC, telomerleri uzatmak ve/veya sürdürmek için şablonla telomeraz sağlar. Çoğu insan somatik dokularda algılanamayan telomeraz aktivitesi vardır. DNA polimeraz, telomeraz eksikliği ile birlikte DNA ‘nın gecikme ipliğinin sonunu uzatmak için yetersizlik hücresel bölme her turda sonra telomerlerin ilerici kısaltma yol açar. Bu olayların en somatik hücrelerde kısaltılması telomer neden onlar bir kritik kısaltılmış uzunluğa ulaşıncaya kadar, bu nedenle hücreler çoğaltarak bir devlet girin. Bir hücrenin bölünebilir maksimum sayısı onun telomer uzunluğu tarafından dikte edilir ve bu blok devam hücre bölünmesi için onkatıltı ilerlemesi önlemek için düşünülmektedir7. Kanser hücreleri telomer kaynaklı çoğaltıcı yaşlanma aşmak ve telomerler korumak için telomeraz kullanarak Proliferasyona devam edebiliyoruz. Kanserlerin yaklaşık% 90 ‘ i telomeraz etkinleþtirmek, hem kanser tespiti hem de tedavisinde telomeraz aktivitesini eleştirel olarak önemli hale getirmektedir.
1990 ‘ lardaki TRAP tahlili ‘nin geliştirilmesi, telomeraz enziminin gerekli bileşenlerinin tanımlanması ve hem normal hem de kanserli geniş bir hücre ve dokularda telomeraz ölçümü için de yararlı oldu. Orijinal jel tabanlı PCR tahlil telomeraz etkinliğini algılamak için radyoaktif etiketli DNA substratlar kullandı. 2006 yılında, tahlil floresan etiketli substratlar kullanarak radyoaktif olmayan bir forma adapte edildi8,9. Floresan etiketli substratlar kullanarak, kullanıcılar doğru uyarılma dalga boyu açığa tarafından bir jel bantları olarak telomeraz uzatma ürünleri görselleştirmek başardık. Trap tahlil ve ham hücre endoglikozidazları içinde telomeraz etkinliğini algılamak için yeteneğini hassasiyeti bu tahlil telomeraz aktivite algılama için en yaygın kullanılan yöntemi yaptı. Ancak, TRAP tahlil sınırlamaları vardır. Tahlil jel tabanlı, zor orta yüksek verimlilik çalışmaları için gerekli çoğaltır gerçekleştirmek için yapma, ve böylece, uygun istatistiksel analiz nadiren elde edilir. Ayrıca, jel bazlı tahlil, numuneler arasında telomeraz aktivitesinde iki kat farklılıkları daha az tespit edilememesi nedeniyle güvenilir bir şekilde ölçmek zordur. Bu iki sınırlamaların üstesinden gelmek, hasta örneklerinde veya ilaç tasarım çalışmalarında telomeraz aktivitesinin algılanması için klinik veya endüstri ayarlarına geçmek için TRAP gibi enzimatik aktivite açısından önemlidir.
Dijital PCR başlangıçta bir doğrusal ve dijital tahlil10içine PCR üstel ve analog doğası dönüştürmek için bir araç olarak 1999 yılında geliştirilmiştir. Droplet dijital PCR (ddPCR) orijinal dijital PCR metodolojisi en son yenilik. Damlacık dijital PCR, güvenilir ve eşit boyutta damlacıklar oluşturmak için gelişmiş mikrofluidikler ve yağ-in-su emülsiyon Kimya gelişiyle ilgili olarak geldi. Jel bazlı ve hatta nicel PCR (qPCR) ‘ den farklı olarak, ddPCR giriş malzemesinin mutlak ölçülmesini üretir. DdPCR anahtarı nesil olduğunu ~ 20.000 bireysel reaksiyonlar örnekleri damlacıklar bölümleme tarafından. Son nokta PCR aşağıdaki, damlacık okuyucu her damlacık bir akış-cytometer benzeri moda, sayma, boyutlandırma, ve (yani, yok veya her damlalar içinde PCR amplikonlar varlığı) floresans varlığı veya yokluğu kayıt tarar. Sonra, Poisson dağıtımı kullanarak, giriş molekülleri damlacıklar toplam sayısına pozitif damlacıklar oranına göre tahmin edilir. Bu sayı, her PCR ‘de giriş moleküllerinin sayısını tahmin eder. Ayrıca, ddPCR, kullanıcının birçok numuneyi çalıştırmasına izin veren ve uygun istatistiksel analizler için biyolojik ve teknik çoğaltır gerçekleştiren bir 96-Well plaka üzerinde gerçekleştirilir ve analiz edilir. Sonuç olarak, biz ddtrap tahlil11geliştirmek için tuzak tahlil ile ddpcr güçlü kantifikasyon ve orta verim doğası kombine ettik. Bu tahlil, kullanıcıların biyolojik örneklerden mutlak telomeraz etkinliğini incelemek ve sağlamlaştırmak için tasarlanmıştır11,12. DdTRAP hassasiyeti, tek hücreli ölçümler dahil olmak üzere sınırlı ve değerli örneklerden telomeraz aktivitesinin ölçülmesini sağlar. Ayrıca, kullanıcılar aynı zamanda telomeraz manipülasyonları ve/veya ilaçlar (~ 50% farklılıklar) iki kat değişikliklerden daha az mutlak kantifikasyon etkileri araştırabilirsiniz. DdTRAP modern laboratuar deneyleri ve klinik ayarları dijital ve daha yüksek verim doğası içine TRAP tahlil doğal evriminin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Telomeraz aktivitesinin ölçümü, kanser, telomer biyolojisi, yaşlanma, rejeneratif tıp ve yapı bazlı ilaç tasarımı dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, araştırma konularının bir bolluk için önemlidir. Telomeraz RNPs düşük bol, kanser hücrelerinde bile, algılama ve bu enzim zorlu çalışma yapma. Bu yazıda, yeni geliştirilen ddTRAP tahlili için adım adım prosedürleri, hücrelerde telomeraz aktivitesini sağlam bir şekilde ölçmek için tarif ettik. Geleneksel telomeraz uzatma reaks…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Sağlık Ulusal Enstitüleri (NıH) (CCI-R00-CA197672-01A1) fon kaynaklarını kabul etmek istiyorum. Küçük hücreli akciğer kanseri hatları (SHP77 ve H82), UT Southwestern Tıp Merkezi ‘nden DRS. John Minna ve adi Gazdar ‘dan cömert bir hediyeydi.
Materials
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
Riferimenti
- Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell. 59 (3), 521-529 (1989).
- de Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Role of telomeres and telomerase in cancer. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).
- Kim, W., Shay, J. W. Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD). Differentiation. 99, 1-9 (2018).
- Robin, J. D., et al. Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances. Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase. Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).
- Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Enhanced detection of human telomerase activity. DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).
- Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol. Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).
- Huang, E. E., et al. The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation. Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).
- Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity. Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).
