Dråpe Digital TRAP (ddTRAP): tilpasning av telomere gjenta forsterkning protokoll til dråpe Digital polymerase Kjedere reaksjon
Summary
Vi klarte å konvertere standard telomere gjenta forsterkning protokollen (TRAP) analysen skal benyttes i dråpe Digital polymerase kjedereaksjoner. Denne ny analysen, alarmert ddTRAP, er flere følsom og kvantitativ, tillater for bedre oppdagelsen og statistisk analyse av telomerase aktivitet innen forskjellige Human celler.
Abstract
Den telomere gjenta forsterkning protokollen (TRAP) er den mest brukte analysen for å oppdage telomerase aktivitet innenfor en gitt en prøve. Den polymerase kjedere reaksjonen (PCR)-baserte metoden gjør det mulig for robuste målinger av enzym aktivitet fra de fleste celle lysater. Den gel-baserte TRAP med fluorescensmerkete merket primere begrenser sample gjennomstrømning, og evnen til å oppdage forskjeller i prøvene er begrenset til to fold eller større endringer i enzym aktivitet. Dråpe Digital TRAP, ddTRAP, er en svært følsom tilnærming som har blitt modifisert fra den tradisjonelle TRAP analysen, slik at brukeren kan utføre en robust analyse på 96 prøver per kjøre og få absolutt kvantifisering av DNA (telomerase forlengelse produkter ) inn data i hver PCR. Den nyutviklede ddTRAP-analysen overvinner derfor begrensningene til den tradisjonelle gel-baserte TRAP-analysen og gir en mer effektiv, nøyaktig og kvantitativ tilnærming til måling av telomerase aktivitet innenfor laboratorie-og kliniske miljøer.
Introduction
Telomerer er dynamiske DNA-protein komplekser i endene av lineære kromosomer. Human telomerer er sammensatt av et utvalg av 5 ‘-TTAGGGn hexameric repetisjoner som varierer i lengde mellom 12-15 kilobases (KB) ved fødselen1. Human telomerase, den ribonucleoprotein enzym som opprettholder telomerer, ble først identifisert i HeLa celle lysater (kreftcelle linje)2. Sammen telomerer og telomerase spille en viktig rolle i et spekter av biologiske prosesser som Genova beskyttelse, gen regulering, og kreftcelle udødelighet3,4,5,6.
Human telomerase består hovedsakelig av to viktige komponenter, nemlig telomerase Reverse transkriptase og telomerase RNA (hTERT og hTERC, henholdsvis). Proteinet delenhet, hTERT, er katalytisk aktiv revers transkriptase komponent av telomerase enzymet. RNA-malen, hTERC, gir telomerase med malen for å utvide og/eller vedlikeholde telomerer. De fleste menneskelige somatiske vev har ingen synlig telomerase aktivitet. Manglende evne til DNA polymerase å forlenge slutten av henger strand av DNA sammen med mangelen på telomerase fører til progressiv forkortelse av telomerer etter hver runde av cellulære divisjon. Disse fenomener føre til telomere forkortelse i de fleste somatiske celler til de når en kritisk forkortet lengde, der cellene inn i en tilstand av replicative senescence. Maksimalt antall ganger en celle kan dele er diktert av sin telomere lengde og denne blokken til fortsatt celledeling antas å hindre progresjon til oncogenesis7. Kreftceller er i stand til å overvinne telomere-indusert replicative senescence og fortsette å spre ved å utnytte telomerase å opprettholde sin telomerer. Ca 90% av kreft aktivere telomerase, noe som gjør telomerase aktivitet kritisk viktig i både kreft deteksjon og behandling.
Utviklingen av TRAP-analysen på 1990-tallet var medvirkende til identifisering av de nødvendige komponentene av telomerase enzym, så vel som for måling av telomerase i et bredt spekter av celler og vev, både normal og kreft. Den opprinnelige gel-baserte PCR-analysen brukte radioaktivt merket DNA-underlag for å oppdage telomerase aktivitet. I 2006 ble analysen tilpasset en radioaktivt form ved hjelp av fluorescensmerkete merket underlag8,9. Ved å bruke fluorescensmerkete merket underlag, brukerne var i stand til å visualisere telomerase forlengelse produkter som band på en gel ved å utsette det til riktig eksitasjon bølgelengde. Følsomheten av TRAP analysen og dens evne til å oppdage telomerase aktivitet i råolje celle lysater har gjort denne analysen den mest brukte metoden for telomerase aktivitet deteksjon. Imidlertid har TRAP-analysen begrensninger. Analysen er gel-basert, noe som gjør det vanskelig å utføre de nødvendige replikerer i moderat til høy gjennomstrømming studier, og dermed riktig statistisk analyse er sjelden oppnådd. Videre er gel-basert analysen vanskelig å kvantifisere pålitelig på grunn av manglende evne til å oppdage mindre enn todelt forskjeller i telomerase aktivitet mellom prøvene. Overvinne disse to begrensningene er avgjørende for enzymatisk aktivitet analyser som TRAP å flytte til kliniske eller industri innstillinger for påvisning av telomerase aktivitet i pasientprøver eller narkotika design studier.
Digital PCR ble opprinnelig utviklet i 1999 som et middel til å konvertere den eksplosive og analoge karakteren til PCR til en lineær og digital analyse10. Dråpe Digital PCR (ddPCR) er den nyeste innovasjonen av den opprinnelige digitale PCR-metodikken. Dråpe Digital PCR kom med bruk av avansert materialer og olje-i-vann emulsjon kjemi for å pålitelig generere stabile og like store dråper. I motsetning til gel-basert og selv kvantitativ PCR (qPCR), ddPCR genererer absolutt kvantifisering av input materiale. Nøkkelen til ddPCR er generering av ~ 20 000 individuelle reaksjoner ved å partisjonere prøvene i dråper. Etter ende punkts PCR, skanner dråpe leseren hver dråpe i en Flow-flowcytometer mote, telling, dimensjonering, og registrerer tilstedeværelsen eller fraværet av fluorescens i hvert enkelt dråpe (dvs. fravær eller tilstedeværelsen av PCR-amplicons i hver dråpe). Deretter, ved hjelp av Poisson-fordelingen, anslås inn data molekyler basert på forholdet mellom positive dråper og totalt antall dråper. Dette tallet representerer et anslag over antall inn data molekyler i hver PCR. Videre er ddPCR utført og analysert på en 96-brønn plate som gjør det mulig for brukeren å kjøre mange prøver, samt utføre biologiske og tekniske replikerer for riktig statistisk analyse. Som et resultat, har vi kombinert den kraftige kvantifisering og moderat gjennomstrømming natur ddPCR med TRAP analysen å utvikle ddTRAP analysen11. Denne analysen er utformet for brukere å studere og robust kvantifisere absolutt telomerase aktivitet fra biologiske prøver11,12. Følsomheten til ddTRAP tillater kvantifisering av telomerase aktivitet fra begrensede og dyrebare prøver, inkludert enkelt celle målinger. Videre, brukernes kanne likeledes studere effektene av telomerase manipulasjoner og/eller medikamenter med absolutt kvantifisering av mindre enn todelt endre (~ 50% forskjellene). Den ddTRAP er den naturlige utviklingen av TRAP analysen i den digitale og høyere gjennomstrømming natur moderne laboratorieeksperimenter og kliniske innstillinger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målingen av telomerase aktivitet er avgjørende for en mengde forsknings temaer, inkludert, men ikke begrenset til, kreft, telomere biologi, aldring, regenererende medisin og struktur BAS ert legemiddel design. Telomerase RNPs er lave rikelig, selv i kreftceller, noe som gjør oppdagelsen og studiet av dette enzymet utfordrende. I denne utredningen, beskrev vi trinn-for-trinn prosedyrer for den nyutviklede ddTRAP analysen til robust kvantifisere telomerase aktivitet i cellene. Ved å kombinere den tradisjonelle telomera…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne erkjenne finansieringskilder fra National Institutes of Health (NIH) (NCI-r00-CA197672-01A1). Små celle lungekreft linjer (SHP77 og H82) var en generøs gave fra DRS. John Minna og Adi Gazdar fra UT Southwestern Medical Center.
Materials
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
Riferimenti
- Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell. 59 (3), 521-529 (1989).
- de Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Role of telomeres and telomerase in cancer. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).
- Kim, W., Shay, J. W. Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD). Differentiation. 99, 1-9 (2018).
- Robin, J. D., et al. Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances. Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase. Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).
- Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Enhanced detection of human telomerase activity. DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).
- Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol. Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).
- Huang, E. E., et al. The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation. Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).
- Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity. Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).
