거대한 소포 내부의 단세포 수준에서 세균 세포 배양
Summary
우리는 거대한 소포 (GV) 안쪽에 박테리아의 단세포 배양을 보여줍니다. 세균 세포를 함유하는 GV는 액적 전달 방법에 의해 제조되었고, 세균 성장의 직접적인 관찰을 위해 유리 기판 위에 지지막 에 고정시켰다. 이 접근은 또한 그밖 세포에 적응할 수 있습니다.
Abstract
우리는 거대한 소포 (GV) 안쪽에 단세포 수준에서 세균성 세포를 배양하는 방법을 개발했습니다. 세균 세포 배양은 자연 환경에서 세균 세포의 기능을 이해하는 데 중요합니다. 기술적인 진보 때문에, 다양한 세균성 세포 기능은 밀폐된 공간 안쪽에 단세포 수준에서 드러나질 수 있습니다. GV는 양과성 지질 분자로 구성된 구형 마이크로 크기의 구획이며 세포를 포함한 다양한 물질을 보유 할 수 있습니다. 본 연구에서, 단일 세균 세포를 액적 전달 방법에 의해 10-30 μm GV로 캡슐화하고, 세균 세포를 함유하는 GV를 유리 기판 상에서 지지막 상에 고정시켰다. 우리의 방법은 GV 내부의 단일 박테리아의 실시간 성장을 관찰하는 데 유용합니다. 우리는 대장균 (대장균) 세포를GV 내부의 모델로 배양했지만,이 방법은 다른 세포 유형에 적응 할 수 있습니다. 우리의 방법은 미생물학, 생물학, 생명 공학 및 합성 생물학의 과학 및 산업 분야에서 사용될 수 있습니다.
Introduction
단일 세포 수준에서 세균 세포의 배양은 점점 더 주목을 받고 있다. 밀폐된 공간 내부의 단일 세포 수준에서 세균 세포를 배양하면 자형형 가변성1,2,3,4,세포 동작5, 6개 , 7명 , 8개 , 9,항생내성10,11. 배양 기술의 최근 발전으로 인해, 단일 박테리아의 배양은 잘 칩4,7,8,젤 방울12,13과 같은 제한된 공간 내에서 달성 될 수있다 및 물 -에 – 오일 (W/ O) 물방울 5,11. 단일 세균 세포의 이해 또는 활용을 촉진하기 위해 재배 기술의 추가 기술 개발이 필요합니다.
생물학적 세포막을 모방하는 소포는 양서류 분자로 구성된 구형 구획이며 다양한 물질을 보유할 수 있습니다. 소포는 크기에 따라 분류되며 소형 소포(SV, 직경 및 100nm), 대형 소포(LAV, lt;1 μm) 및 거대 소포(GV, >1 μm)를 포함합니다. SV 또는 ROV는 생물학적 세포막(14)에 대한 그들의친화성 때문에 약물 담체로서 일반적으로 사용된다. GV는 또한프로토셀(15) 또는 인공세포(16)의시공을 위한 반응기 시스템으로 사용되어 왔다. 생물학적 세포를 GV내로 캡슐화한 것은 17, 18, 이에 따라 반응기 시스템과 결합될 때 세포 배양 시스템으로서의 잠재력을 보여준다고17,18.
여기서, 실험 적인 절차의 비디오와 더불어, 우리는 GV가 새로운 세포 배양 용기로 이용될 수 있는 방법19를기술합니다. 박테리아를 함유하는 GV는 액적 전달 방법(20)에 의해 제조된 후 커버 유리 에 지지된 막에 고정시켰다. 우리는 실시간으로 GV 내부의 단일 세포 수준에서 세균 성장을 관찰하기 위해이 시스템을 사용했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서, 우리는 GV 내부의 단세포 수준에서 세균 세포를 배양하는 방법을 기술한다. 이 간단한 방법은 액적 전달 방법을 사용하여 단일 세포 수준에서 세균 세포를 포함하는 GV를 형성하는 것을 포함한다. 세균 세포를 함유하는 GV를 얻기 위한 다른 접근법과 비교하여, 이 방법은 두 가지 장점이 있다: (i) 개발하기 쉽고, (ii) 샘플 용액의 작은 부피(2 μL)가 GV를 제조하는 데 필요하다. 세균세포를 함유…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 일본 의 문부과학성(MEXT)의 우수 청년 연구자(리더, 제16812285호)의 우수 청년 연구자 주도 이니셔티브(16812285호)와 젊은 과학자 연구 보조금(18K18157, 16K21034)의 지원을 받았습니다. 일본과학진흥회(JSPS)에서 M.M.까지, MEXT에서 K.K.까지 의학지원(No. 17H06417, 17H06413).
Materials
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Cover glass (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | thickness 0.13–0.17 mm |
| Cover glass (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | thickness 0.25–0.35 mm |
| Desktop centrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | swing rotor type |
| Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glass vial | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentation tube |
| Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Microscopic heating stage system | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineral oil | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objective lens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids | 610005 | pore size 100 nm |
| sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Sodium chloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultrasonic bath | AS ONE | ASU-3D | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL lidded plastic tube | Watson | 130-806C | |
| 1.5 mL lidded plastic tube | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
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