नि: शुल्क चल इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख द्वारा Cutaneous पेरिफेरल तंत्रिका फाइबर में अल्फा सिन्यूक्लिइन सकल लक्ष्य
Summary
यहाँ, हम त्वचा बायोप्सी वर्गों पर एक मुक्त चल अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो पार्किंसंस रोग और कई प्रोटीन में शामिल अल्फा सिन्यूक्लिइन के रोग विशिष्ट अनुरूपता वेरिएंट की पहचान के लिए अनुमति देता है परिधीय तंत्रिका तंत्र.
Abstract
तारीख करने के लिए, सबसे neurodegenerative रोगों के लिए केवल एक पोस्ट-मॉर्टम हिस्टोपैथोलॉजिकल निश्चित निदान उपलब्ध है। पार्किंसंस रोग (पीडी) के लिए, निदान अभी भी केवल मोटर भागीदारी के नैदानिक लक्षण पर निर्भर करता है जो बाद में रोग पाठ्यक्रम में दिखाई देते हैं, जब डोपामाइनर्जिक न्यूरॉन्स के अधिकांश पहले से ही खो जाते हैं। इसलिए, एक बायोमार्कर की सख्त जरूरत है जो बीमारी की शुरुआत में या इसे विकसित करने के जोखिम पर रोगियों की पहचान कर सकता है। पिछले कुछ वर्षों में, त्वचा बायोप्सी इस तरह के छोटे फाइबर न्यूरोपैथी के रूप में परिधीय तंत्रिका रोगों के लिए एक उत्कृष्ट अनुसंधान और नैदानिक उपकरण साबित हो गया है। दिलचस्प है, एक छोटे से फाइबर न्यूरोपैथी और अल्फा synuclein (जेडसिन) तंत्रिका जमा पीडी रोगियों में त्वचा बायोप्सी द्वारा दिखाया गया है. दरअसल, त्वचा बायोप्सी एक आसानी से सुलभ होने का महान लाभ है, न्यूनतम इनवेसिव और दर्द रहित प्रक्रिया है कि परिधीय तंत्रिका रोग विज्ञान के लिए प्रवण ऊतक के विश्लेषण की अनुमति देता है. इसके अलावा, एक ही रोगी के अनुवर्ती के दौरान त्वचा बायोप्सी को दोहराने की संभावना रोग प्रगति के साथ अनुदैर्घ्य सहसंबंध का अध्ययन करने की अनुमति देता है। हम पीडी रोगी की त्वचा तंत्रिका फाइबर में सिन समुच्चय की उपस्थिति की जांच करने के लिए एक मानकीकृत विश्वसनीय प्रोटोकॉल की स्थापना की। इस प्रोटोकॉल कुछ कम निर्धारण कदम शामिल है, एक cryotome अनुभाग और फिर एक मुक्त चल इम्यूनोफ्लोरेसेंस डबल दो विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ दाग: विरोधी प्रोटीन जीन उत्पाद 9.5 (PGP9.5) cutaneous तंत्रिका फाइबर और पता लगाने के लिए विरोधी 5G4 चिह्नित करने के लिए $सिन समुच्चय. यह एक बहुमुखी, संवेदनशील और प्रोटोकॉल है कि भी त्वचा नसों में ब्याज के अन्य प्रोटीन को लक्षित करने के लिए लागू किया जा सकता है प्रदर्शन करने के लिए आसान है. पीडी के एक पूर्व-मर्द हिस्टोपैथोलॉजिकल निदान की स्थापना के लिए एक उपकरण के रूप में त्वचा बायोप्सी के उपयोग के लिए एक और कदम आगे है – सिन समुच्चय को चिह्नित करने की क्षमता।
Introduction
त्वचा बायोप्सी मस्तिष्क संबंधी विकारों1के क्षेत्र में नैदानिक और अनुसंधान उपकरण के रूप में एक महान महत्व हासिल कर लिया है . वास्तव में, बाह्य त्वचा और dermis प्रचुर मात्रा में दैहिक संवेदी तंत्रिका फाइबर होते हैं (myelinated और unmyelinated), nociceptive मुक्त तंत्रिका अंत, संवेदी रिसेप्टर्स और पसीना ग्रंथियों के autonomic innervation, वाहिकाओं, वसामय ग्रंथियों और मांसपेशियों arrector pilorum 2.
मध्य 20वीं सदी में, PGP9.5 एंटीबॉडी के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए सेटअप मानव epidermis स्तनधारी त्वचा3के एक व्यापक innervation के सबूत की अनुमति दी. PGP9.5 एक carboxyl-टर्मिनल hydrolase समान रूप से दोनों केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका तंत्र (PNS) के axons के साथ वितरित है. इस एंटीबॉडी की उपलब्धता ने न केवल त्वचा में पीएनएस की आकृति विज्ञान और शरीर रचना को स्पष्ट करने की अनुमति दी बल्कि इससे जुड़े रोगों के अध्ययन को भी लागू किया3,4. त्वचा बायोप्सी एक नई नैदानिक इकाई को परिभाषित करने के लिए योगदान दिया: छोटे फाइबर न्यूरोपैथी. कई अंतरराष्ट्रीय समूहों intraepidermal तंत्रिका फाइबर और लक्षण के नुकसान के बीच संबंध का प्रदर्शन किया 5 त्वचा बायोप्सी विश्लेषण द्वारा छोटे फाइबर न्यूरोपैथी के लक्षण और तंत्रिका morphometry के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रदान के रूप में अच्छी तरह से नैदानिक अभ्यास6,7,8में प्रयुक्त होने वाले मानक संदर्भ मान .
हाल ही में सबूत की एक बड़ी राशि से पता चला है कि neurodegenerative रोगों, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में misfolded प्रोटीन संचय की विशेषता, बहु प्रणाली रोगों9हैं. वास्तव में, पीडी सबस्टेनिया नाइग्राके डोपामिनर्जिक न्यूरॉन में सिन संचय की विशेषता है, लेकिन यह प्रदर्शित किया गया है कि [सिन और इसके रोगात्मक रूप, फॉस्फोरीलेटिड ]सिन (पी-सिन), परिधीय ऊतकों में भी पता लगाया जा सकता है। गैस्ट्रो आंत्र श्लेष्म10, लार ग्रंथियों11, पसीना ग्रंथियों और pilomotor मांसपेशियों के आसपास त्वचा autonomic फाइबर12,13,14, में , के रोगजनक रूपों के लिए इम्यूनोरेसक्रियता दिखाते हैं Braak परिकल्पना के अनुसार कि पेचीदा ढंग से यह अनुमान लगाया गया है कि पीएनएस में मस्तिष्क15में इसके संचय से पहले , पीएनएस में अच्छी तरह से शुरू हो सकता है . इसके अलावा, पी-सिन की उपस्थिति रेम व्यवहार विकार है कि prodromal पीडी16माना जाता है के साथ रोगियों की त्वचा नसों में प्रदर्शन किया गया है,17 इस प्रकार त्वचा रोग विज्ञान एक आशाजनक जल्दी परिधीय माना जा सकता है सिन्यूक्लिइनोपैथी का हिस्टोपैथोलॉजिकल मार्कर.
पीडी में छोटे फाइबर न्यूरोपैथी के सहयोग का प्रदर्शन पहले किया गया है और यह पाया गया है कि इंट्राएपिडर्मल तंत्रिका फाइबर घनत्व रोग प्रगति को दर्शाता है18,19. इसलिए, त्वचा बायोप्सी पीडी में neurodegeneration का अध्ययन करने के लिए और रोग के एक पूर्व पोस्टमार्टम हिस्टोपैथोलॉजिकल निदान की स्थापना के लिए एक उपयोगी उपकरण है. दरअसल, त्वचा बायोप्सी एक आसानी से सुलभ और न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रिया होने का एक बड़ा लाभ है, तंत्रिका रोग विज्ञान के लिए प्रवण ऊतक के विश्लेषण की अनुमति. अंत में, एक ही रोगियों के अनुवर्ती के पाठ्यक्रम में त्वचा बायोप्सी दोहराने की संभावना रोग प्रगति के साथ अनुदैर्घ्य सहसंबंध का अध्ययन करने की अनुमति देता है।
हमारी प्रयोगशाला में, PGP9.5 और रचना-विशिष्ट monoclonal 5G4 एंटीबॉडी के साथ एक डबल इम्यूनो-स्टेनिंग का शोषण, कि छोटे समुच्चय सहित के रोग विशिष्ट रूपों को पहचानता है20,21, हम दिखाने में सक्षम थे एक आशाजनक उच्च नैदानिक दक्षता19के साथ त्वचा नसों में सिन समुच्चय की उपस्थिति . conformational रोगों में त्वचा बायोप्सी के इम्यूनोफ्लोरेसिस विश्लेषण दोनों प्रोटीन समुच्चय का पता लगाने और विवो में neurodegeneration के उपाय के संयोजन के द्वारा biomarkers का एक आशाजनक स्रोत के रूप में बाहर खड़ा है. इसके बाद, हम त्वचा बायोप्सी से निपटने और मुक्त चल इम्यूनोफ्लोरेसी दाग प्रदर्शन पर एक आसान और बहुमुखी प्रोटोकॉल वर्णन [सिन समुच्चय का पता लगाने के लिए. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल त्वचा PNS में व्यक्त ब्याज के किसी भी अन्य प्रोटीन को लक्षित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
निम्नलिखित अध्ययन प्रोटोकॉल का उपयोग त्वचा बायोप्सी19द्वारा पीडी के पीएनएस में एकत्रित सिन विश्लेषण की नैदानिक उपयोगिता का मूल्यांकन करने के लिए किया गया है . पीडी के लिए शामिल किए गए मानदंड थे: ब्रिटेन मस्तिष्क बैंक नैदानिक मानदंडों के अनुसार एक निश्चित नैदानिक निदान, रोग की अवधि कम से कम 3 साल, कोई परिवार के इतिहास, और कोई प्रमुख संज्ञानात्मक हानि या इतिहास में प्रमुख dysautonomic लक्षण. बहिष्करण मानदंड न्यूरोपैथी (ग्लीकेम्ड हीमोग्लोबिन, क्रिएटिनिन, विटामिन बी 12, टीएसएच, सीरम इम्यूनोफिक्सेशन, एचआईवी, एचसीवी, सिफलिस, और बोरेलियोसिस) के ज्ञात कारण थे। प्रत्येक विषय तीन शारीरिक स्थलों पर 3 मिमी व्यास त्वचा बायोप्सी के लिए लिया (C8 त्वचा स्तर पर गर्दन, घुटने के ऊपर जांघ 10 सेमी, पैर 10 सेमी पार्श्व malleolus से ऊपर) पक्ष है, जो चिकित्सकीय अधिक प्रभावित किया गया था. सामान्य में, निम्नलिखित प्रोटोकॉल त्वचा बायोप्सी से निपटने और मुक्त चल इम्यूनोफ्लोरेसी धुंधला और विश्लेषण प्रदर्शन के बारे में है। इसलिए यह अनुकूलित किया जा सकता है और त्वचा के ऊतकों में ब्याज की अन्य प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम पीडी के निदान के लिए त्वचा बायोप्सी के लिए एक मुक्त चल इम्यूनोफ्लोरेसींस परख का वर्णन: यह विरोधी PGP9.5 एंटीबॉडी, एक panaxonal मार्कर, और विरोधी 5G4, एक अनुरूपता विशिष्ट एंटीबॉडी है कि एकत्रित रूप पहचानता है के स?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस अध्ययन के अपने वित्तीय समर्थन के लिए पार्किंसंस Schweiz और ABREOC (एंटे Ospedaliero Cantonale के वैज्ञानिक अनुसंधान सलाहकार बोर्ड) धन्यवाद.
Materials
| 5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
| AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2mg/ml |
| AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2mg/ml |
| Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
| Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |
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