자유 부동 면역 형광 분석에 의하여 절단 말초 신경 섬유에 있는 알파 Synuclein 응집체를 표적으로 하는
Summary
여기에서, 우리는 파킨슨 병및 파킨슨 병에 관여하는 알파 시누클레인의 질병 특정 형태 변이체의 식별을 허용하는 피부 생검 섹션에 자유 부동 간접 면역 형광 분석에 대한 프로토콜을 제시하고 말초 신경계.
Abstract
현재까지 대부분의 신경 퇴행성 질환의 경우 사후 조직 병리학적 결정적 진단만 가능합니다. 파킨슨 병 (PD)의 경우, 진단은 여전히 도파민성 뉴런의 대부분이 이미 손실 된 질병 과정에서 나중에 나타나는 운동 관련 의 임상 징후에만 의존합니다. 그러므로, 질병의 시작또는 그것을 개발의 위험한 상태에 환자를 확인할 수 있는 biomarker를 위한 강한 필요가 있습니다. 지난 몇 년 동안, 피부 생검은 작은 섬유 신경 병증과 같은 말초 신경 질환에 대한 훌륭한 연구 및 진단 도구로 입증되었습니다. 흥미롭게도, 작은 섬유 신경 병 증 및 알파 synuclein (αSyn) 신경 예금 PD 환자에서 피부 생 검에 의해 표시 되었습니다. 실제로, 피부 생검은 병리학에 수그린 말초 신경 조직의 분석을 허용하는 쉽게 접근할 수 있고, 최소침습및 고통없는 절차인의 큰 이점이 있습니다. 더욱이, 동일한 환자의 후속 조치 과정에서 피부 생검을 반복할 수 있는 가능성은 질병 진행과의 종방향 상관관계를 연구할 수 있게 한다. 우리는 PD 환자의 피부 신경 섬유에서 αSyn 응집체의 존재를 조사하기 위해 표준화 된 신뢰할 수있는 프로토콜을 설정합니다. 이 프로토콜은 몇 가지 짧은 고정 단계, 극저온 절편 및 다음 두 개의 특정 항체와 자유 부동 면역 형광 이중 염색을 포함: 항 단백질 유전자 제품 9.5 (PGP9.5) 검출을위한 절단 신경 섬유 및 항 5G4를 표시하기 위해 αSyn 집계. 그것은 또한 피부 신경에 관심있는 다른 단백질을 대상으로 적용 할 수있는 다재 다능하고 민감하고 수행하기 쉬운 프로토콜입니다. αSyn 응집체를 표시하는 능력은 PD의 사전 모뎀 조직 병리학 진단을 확립하기위한 도구로 피부 생검의 사용에 또 다른 단계 앞으로.
Introduction
피부 생검은 신경 장애 분야의 진단 및 연구 도구로서 큰중요성을 획득했습니다 1. 실제로, 표피와 진피는 풍부한 신체 감각 신경 섬유를 포함 (myelinated 및 unmyelinated), nociceptive 무료 신경 엔딩, 감각 수용체 및 땀샘의 자율 적 내심, 혈관, 피지선과 근육 arrector pilorum 2.
20세기 중반에, PGP9.5 항체의 면역운동화학에 대한 설정은 인간 표피 포유류 피부의 광범위한 내막의 증거를 허용했다3. PGP9.5는 중추 및 말초 신경계(PNS)의 축축을 따라 균등하게 분포된 카복실 말단 하이드라제이다. 이 항체의 가용성은 피부에서 PNS의 형태 및 해부학을 명확히 할뿐만 아니라3,4와관련된 질병에 대한 연구를 구현할 수있었습니다. 피부 생검은 새로운 임상 엔티티를 정의하는 데 기여했습니다: 작은 섬유 신경병. 몇몇 국제적인 단은 피부 생검 분석에 의하여 작은 섬유 신경병의 경피 신경 섬유의 손실 및 현상/표시 사이 협회를 보여주었고 신경 morphometry를 위한 표준화한 프로토콜을 제공했습니다. 임상 실습6,7,8에사용되는 규범적 기준값.
최근 많은 양의 증거가 중추 신경계에서 잘못 접힌 단백질 축적을 특징으로하는 신경 퇴행성 질환이 다중 시스템 병리학인것으로나타났습니다 9. 실제로, PD는 체질니그라의도파민성 뉴런에서 αSyn 축적을 특징으로 하지만, αSyn 및 그의 병리학적 형태, 인산화αSyn(P-αSyn)이 말초 조직에서도 검출될 수 있음을 입증되었다. 위장관 점막10,침샘11,땀샘 및 필로모터 근육을 둘러싼 피부 자율 섬유12,13,14,αSyn의 병원성 형태에 대한 면역 반응성, Braak 가설에 따르면 αSyn 병리학이 뇌에 축적되기 전에 PNS에서 잘 시작될 수 있다고 흥미롭게 가정합니다15. 또한, p-αSyn의 존재는 프로드로멀 PD16,17따라서 피부 병리학αSyn이 유망한 초기 말초로 간주될 수 있는 REM 행동 장애를 가진 환자의 피부 신경에서 입증되었다. 조직병리학적 세포병리학적 마커.
PD에서 작은 섬유 신경병증의 연관성은 이전에 입증되었으며 상피 내 신경 섬유 밀도가 질병 진행을 반영하는 것으로 나타났다18,19. 따라서, 피부 생검은 PD에 있는 신경 변성을 공부하고 질병의 pre-mortem 조직 병리학 진단을 설치를 위한 유용한 공구입니다. 실제로, 피부 생검은 병리학에 수그린 신경 조직의 분석을 허용하는 쉽게 접근하고 최소침습 절차인의 큰 이점이 있습니다. 마지막으로, 동일한 환자의 후속 과정에서 피부 생검을 반복할 수 있는 가능성은 질병 진행과의 세로 상관 관계를 연구할 수 있게 합니다.
우리의 실험실에서, PGP9.5및 형태 특이적 단일클론 5G4 항체로 이중 면역 염색을 이용하고, 작은 응집체20,21을포함하는 αSyn의 질병 특이적 형태를 인식하는, 유망한 높은 진단 효율성과 피부 신경에 αSyn 응집체의 존재19. 형태 질환에서 피부 생검의 면역 형광 분석은 단백질 응집체의 검출과 생체 내 신경 변성의 측정을 모두 결합하여 바이오 마커의 유망한 공급원으로 두드러집니다. 이하, 우리는 αSyn 응집체검출을 위한 피부 생검 및 자유 부동 면역형광 염색을 수행하는 것에 대한 쉽고 다양한 프로토콜을 설명한다. 더욱이, 이 프로토콜은 피부 PNS에서 발현되는 관심 있는 임의의 다른 단백질을 표적화하기 위해 적응될 수 있다.
이하의 연구 프로토콜은 피부 생검19에의한 PD의 PNS에서 응집된 αSyn 분석의 진단 유틸리티를 평가하는 데 사용되었다. PD를 위한 포함 기준은: UK Brain Bank 진단 기준에 따라 명확한 임상 진단, 질병 기간 적어도 3 년, 아니 가족력, 및 역사에 있는 중요한 인식 손상 또는 중요한 dysautonomic 현상. 배제 기준은 신경병증(당화혈색소, 크레아티닌, 비타민 B12, TSH, 혈청 면역수정, HIV, HCV, 매독 및 보렐리아증)의 원인으로 알려졌다. 각 대상체는 3개의 해부학적 부위(C8 피부 수준에서 목, 무릎 위 허벅지 10cm, 측면 malleolus 위 다리 10cm)에서 3mm 직경의 피부 생검을 시행했으며, 이는 임상적으로 더 영향을 받았습니다. 일반적으로, 이하의 프로토콜은 피부 생검을 처리하고 자유 부동 면역형광 염색 및 분석을 수행하는 것에 관한 것입니다. 따라서 피부 조직에 관심 있는 다른 단백질의 검출을 위해 적응및 사용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 PD의 진단을 위한 피부 생검을 위한 자유 부동 면역형 광형 분석분석서를 기술합니다: 그것은 반대로 PGP9.5 항체를 가진 이중 면역 염색을 이용합니다, panaxonal 마커 및 반대로 5G4, 집합된 양식을 인식하는 형태 특정 항체 αSyn.
PD에 있는 진단 목적을 위한 피부 생검의 큰 이점은 그리고 그밖 단백질 형태 무질서에서: 1) 온화한 침략적인 기술에 의하여 질병에 수그린 신경 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 이 연구의 재정적지원을 위해 파킨슨 슈바이츠와 ABREOC(엔테 오스페레아에로 칸토날레의 과학 연구 자문위원회)에게 감사드립니다.
Materials
| 5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
| AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2mg/ml |
| AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2mg/ml |
| Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
| Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |
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