Segmentação de agregados Alpha synuclein em fibras nervosas periféricas cutâneas por ensaio de imunofluorescência livre-flutuante
Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para um ensaio indireto deflutuação da imunofluorescência em seções da biópsia da pele que permita a identificação de variações específicas da conformação da doença do sinucleína alfa envolvido na doença de Parkinson e nas proteínas múltiplas do sistema nervoso periférico.
Abstract
Até agora, para a maioria de doenças neurodegenerativas somente um diagnóstico definitivo histopatológico post-mortem está disponível. Para a doença de Parkinson (DP), o diagnóstico ainda depende apenas de sinais clínicos de comprometimento motor que aparecem mais tarde no curso da doença, quando a maioria dos neurônios dopaminérgicos já estão perdidos. Assim, há uma forte necessidade de um biomarcador que possa identificar os pacientes no início da doença ou com o risco de desenvolvê-lo. Durante os últimos anos, a biópsia da pele provou ser uma pesquisa excelente e uma ferramenta diagnóstica para doenças periféricas do nervo tais como a neuropatia pequena da fibra. Curiosamente, uma pequena neuropatia de fibra e alfa sinucleína (αsyn) depósitos neurais têm sido mostrados por biópsia de pele em pacientes com DP. Na verdade, a biópsia da pele tem a grande vantagem de ser um procedimento facilmente acessível, minimamente invasivo e indolor que permite a análise do tecido nervoso periférico propenso à patologia. Além disso, a possibilidade de repetição da biópsia cutânea no decorrer do seguimento do mesmo paciente permite estudar a correlação longitudinal com a progressão da doença. Nós definimos um protocolo confiável padronizado para investigar a presença de agregados αSyn em fibras nervosas da pele do paciente com DP. Este protocolo envolve poucas etapas curtas da fixação, um seccionamento do cryotome e então uma imunofluorescência livre-flutuante que mancha dobro com dois anticorpos específicos: anti produto 9,5 do gene da proteína (PGP 9.5) para marcar as fibras de nervo Cutaneous e o anti 5G4 para detectar agregados αSyn. É um protocolo versátil, sensível e fácil de executar que também pode ser aplicado para direcionar outras proteínas de interesse em nervos da pele. A capacidade de marcar agregados αSyn é outro passo em frente para o uso da biópsia cutânea como ferramenta para o estabelecimento de um diagnóstico histopatológico pré-morte de DP.
Introduction
A biópsia cutânea adquiriu grande importância como ferramenta diagnóstica e de pesquisa no campo das desordens neurológicas1. Na verdade, a epiderme e a derme contêm abundantes fibras nervosas sensoriais somáticas (mielinizadas e não mielinizadas), terminações nervosas livres nociceptivas, receptores sensoriais e inervação autonômica de glândulas sudoríparas, vasos, glândulas sebáceas e músculo arrector arrectores o 2.
Em meados do século 20 , a instalação de imunoistoquímica do anticorpo PGP 9.5 permitiu a evidência de uma extensa inervação da epiderme humana3. O PGP 9.5 é um hidrolase do carboxyl-terminal distribuído ingualmente ao longo dos axônios do sistema nervoso central e periférico (PNS). A disponibilidade deste anticorpo permitiu não apenas esclarecer a morfologia e a anatomia da PNS na pele, mas também implementar o estudo de doenças associadas a ele3,4. A biópsia da pele contribuiu a definir uma entidade clínica nova: a neuropatia pequena da fibra. Diversos grupos internacionais demonstraram a associação entre a perda de fibras de nervo intraepidérmicas e os sintomas/sinais da neuropatia pequena da fibra5 pela análise da biópsia da pele e forneceram protocolos estandardizados para a morfometria do nervo assim como valores de referência normativos a serem utilizados na prática clínica6,7,8.
Recentemente, uma grande quantidade de evidências mostrou que as doenças neurodegenerativas, caracterizadas por acumulações de proteínas desdobradas no sistema nervoso central, são patologias multissistema9. Na verdade, a DP é caracterizada por acúmulo de αsyn no neurônio dopaminérgico de substância negra nigra, mas tem sido demonstrado que αsyn e sua forma patológica, αsyn fosforilada (P-αsyn), poderiam ser detectadas também nos tecidos periféricos. Mucosa gastro-intestinal10, glândulas salivares11, fibras autonômicas da pele que cercam as glândulas sudoríparas e os músculos pilomotores12,13,14, mostram imunoreatividade a formas patogênicas de αsyn, em acordo com a hipótese de Braak que postular intrigantemente que a patologia de αSyn pode começar no PNS bem adiantado, antes de sua acumulação no cérebro15. Além disso, a presença de p-αsyn foi demonstrada em nervos cutâneos de pacientes com distúrbios do comportamento REM, que são considerados PD16,17 assim, a pele patológica αsyn pode ser considerada um promissor periférico precoce marcador histopatológico de sinucleinopatia.
A associação da neuropatia pequena da fibra no paládio foi demonstrada previamente e verificou-se que a densidade intraepidérmicas das fibras de nervo reflete a progressão da doença18,19. Daqui, a biópsia da pele é uma ferramenta útil para estudar a neurodegeneração no paládio e para estabelecer um diagnóstico histopatológico pre-mortem da doença. Na verdade, a biópsia da pele tem uma grande vantagem de ser um procedimento facilmente acessível e minimamente invasivo, permitindo a análise do tecido nervoso propenso à patologia. Finalmente, a possibilidade de repetição da biópsia cutânea no decorrer do seguimento dos mesmos pacientes permite estudar a correlação longitudinal com a progressão da doença.
Em nosso laboratório, explorando um immuno-mancha dobro com PGP 9.5 e o anticorpo 5g4 monoclonal conformation-específico, que reconhece formulários específicos da doença de αsyn que incluem agregados pequenos20,21, nós pudemos mostrar o presença de agregados de αSyn nos nervos da pele com uma eficiência diagnóstica elevada prometedora19. A análise da imunofluorescência da biópsia da pele em doenças conformacional destaca-se como uma fonte promissora de biomarcadores, combinando tanto a detecção de agregados proteicos quanto a medida da neurodegeneração in vivo. Daqui por diante, nós ilustramos um protocolo fácil e versátil em segurar a biópsia da pele e em executar a mancha da imunofluorescência da livre-flutuação para detectar agregados do αSyn. Além disso, este protocolo pode ser adaptado para alvejar toda a outra proteína do interesse expressada no PNS da pele.
O seguinte protocolo de estudo tem sido utilizado para avaliar a utilidade diagnóstica da análise de αSyn agregada na PNS de DP por biópsia cutânea19. Os critérios de inclusão para DP foram: um diagnóstico clínico definitivo de acordo com os critérios diagnósticos do banco do cérebro do Reino Unido, duração da doença pelo menos 3 anos, sem antecedentes familiares e sem comprometimento cognitivo maior ou sintomas dissautonômicos maiores na história. Os critérios de exclusão foram causas conhecidas de neuropatia (hemoglobina glicada, creatinina, vitamina B12, TSH, Imunofixação sérica, HIV, HCV, sífilis e borreliose). Cada sujeito foi submetido a biópsias cutâneas de 3 mm de diâmetro em três sítios anatômicos (pescoço no nível dermatomal C8, coxa 10 cm acima do joelho, perna 10 cm acima do maléolo lateral) no lado, o que foi clinicamente mais afetado. Geralmente, o seguinte protocolo é sobre a manipulação da biópsia da pele e a realização da coloração e da análise livre-flutuantes da imunofluorescência. Daqui pode ser adaptado e usado para a deteção de outras proteínas do interesse no tecido da pele.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós descrevemos um ensaio de flutuação livre da imunofluorescência para biópsias da pele para o diagnóstico do paládio: explora a imunocoloração dobro com o anticorpo de anti-PGP 9.5, um marcador panaxonal, e o anti-5G4, um anticorpo específico da conformação que reconheça a forma agregada de αSyn.
As grandes vantagens da biópsia da pele para a finalidade diagnóstica no paládio e possivelmente em outras desordens conformacional da proteína são: 1) o acesso direto ao tecido n…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Parkinson Schweiz e ABREOC (o Conselho Consultivo de pesquisa científica do ente Ospedaliero CANTONALE) por seu apoio financeiro deste estudo.
Materials
| 5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
| AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2mg/ml |
| AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2mg/ml |
| Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
| Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |
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