Modelo de impacto cortical controlado da lesão cerebral do rato com transplantação terapêutica de células neurais pluripotentes induzidas humanas da pilha de haste
Summary
Este protocolo demonstra as metodologias para um modelo do rato do ferimento de cérebro traumático do abrir-crânio e a transplantação de pilhas células-derivadas pluripotentes induzidas humanas cultivadas no local da lesão. Os testes comportamentais e histologic dos resultados destes procedimentos são descritos igualmente em breve.
Abstract
A lesão cerebral traumática (TCE) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. A patologia da doença devido ao TBI progride do insulto mecânico preliminar aos processos secundários da lesão, incluindo o apoptose e a inflamação. A modelagem animal tem sido valiosa na busca de desvendar os mecanismos de lesão e avaliar potenciais terapias neuroprotetoras. Este protocolo descreve o modelo de impacto cortical controlado (CCI) de TBI focal, de cabeça aberta. Especificamente, os parâmetros para produzir um ferimento cortical unilateral suave são descritos. As conseqüências comportáveis do CCI são analisadas usando o teste da remoção da fita adesiva da integração sensorimotor bilateral. A respeito da terapia experimental para a patologia de TBI, este protocolo igualmente ilustra um processo para transplantar pilhas cultivadas no cérebro. As culturas de pilha neural derivadas das pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) foram escolhidas para seu potencial mostrar a restauração funcional superior em pacientes humanos de TBI. A sobrevivência crônica de hiPSCs no tecido cerebral do rato do anfitrião é detectada usando um processo immunohistochemical modificado de DAB.
Introduction
A lesão cerebral traumática (TCE) é um termo geral para a lesão adquirida no cérebro devido a forças mecânicas indiretas (aceleração/desaceleração rotacional ou contra-golpe) de golpes na cabeça ou dano direto de objetos ou ondas de explosão. Estima-se que a TBI seja a causa de aproximadamente 9% das mortes mundiais e observada em uma estimativa de 50 milhões casos por ano1,2. Um relatório 2017 dos centros de controle e prevenção de doenças estimou que, em 2013, houve um total de 2,8 milhões visitas hospitalares e óbitos por TBI nos Estados Unidos3. Muitos TBIs mais leves não são relatados todos os anos. TBI grave pode levar ao comprometimento vitalício da cognição, função motora e qualidade de vida geral. As conseqüências da TBI leve, especialmente TBI repetitiva relacionada ao esporte, foram apenas recentemente apreciadas por seus efeitos insidiosos de saúde4,5.
A modelagem pré-clínica é um componente vital do desenvolvimento de novas percepções mecanísticas e da terapia restauradora potencial para a TBI. O modelo controlado do impacto cortical (CCI) de TBI é um modelo da abrir-cabeça de ferimento mecânico da contusão ao córtice. Os parâmetros de impacto podem ser modificados para produzir lesões CCI que variam de leve a grave6. Os ferimentos do CCI são focais um pouco do que difuso, como visto com outros modelos de cabeça fechados de TBI. CCI pode ser realizado para induzir uma lesão unilateral, de tal forma que o córtex contralateral pode servir como um comparador interno. Este protocolo demonstra as características de um CCI suave a uma parcela do córtice que abrange as regiões somatosensory e motoras preliminares. Esta área cortical foi escolhida para sua participação em comportamentos sensorimotor para que os testes de comportamento numerosos podem detectar deficits ferimento-induzidos7. As melhorias comportamentais devido às intervenções terapêuticas para o TBI podem ser detectadas, também.
Uma característica da TBI é a disfunção neural generalizada na região lesada. Neurônios feridos sofrem morte celular, e a conectividade de rede neuronal é interrompida8,9. O TBI interrompe o recrutamento de células-tronco endógenas, o que leva a mais déficits de comportamento downstream10,11. A transplantação de pilhas de haste neural e de pilhas de pilha-derivadas da haste foi explorada como uma possibilidade restaurar a função no cérebro ferido. Além do potencial para restaurar os circuitos neurais danificados, as células transplantadas exercem efeitos paracrinos que promovem a sobrevida neuronal e a recuperação funcional do TBI12. Uma variedade de tipos de células foram transplantadas pré-clinicamente para avaliar seu potencial restaurador em modelos de distúrbios neurológicos13,14,15. A recente popularização da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas16 facilitou o desenvolvimento de inúmeras linhagens de células-tronco humanas para uso experimental. O teste pré-clínico com células derivadas de hiPSC é um primeiro passo importante para caracterizar a potencial eficácia terapêutica de uma determinada linha celular contra doenças humanas. Este laboratório desenvolveu protocolos para diferenciar hipscs aos fenótipos neural17 na perseguição de pilhas transplantáveis para ajudar à recuperação do ferimento de cérebro traumático.
As experiências neste protocolo usam um CCI unilateral para induzir o TBI ao córtice somatosensory e do motor esquerdo de ratos adultos. Uma lesão leve do CCI conduz a um deficit funcional sustentado no forepaw direito que é usado para controlar os efeitos do Engraftment hiPSC-derivado da pilha neural na recuperação funcional. O teste sensorimotor do forepaw neste protocolo foi adaptado da metodologia estabelecida por Bouet e por colegas18 e demonstrado previamente por Fleming e por colegas19. Este protocolo esboça um fluxo de trabalho completo para executar uma lesão cerebral experimental, transplantação terapêutica de pilhas dos quadris, e análise comportamental e histologic de medidas experimentais do resultado.
Protocol
Representative Results
Discussion
CCI leve como um sistema modelo para testar a terapia regenerativa experimental
O modelo CCI é uma ferramenta valiosa para investigar mecanismos de disfunção tecidual após lesão mecânica no córtex. A tunabilidade dos parâmetros de ferimento é uma característica atrativa deste modelo. Alterando a profundidade Z de impacto, a velocidade, ou tempo de permanência pode aumentar ou diminuir a severidade da lesão conforme desejado pelo investigador10,<sup class=…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do centro de neurociência e medicina regenerativa (CNRM, número de subvenção G170244014). Agradecemos a assistência de Mahima Dewan e clara Selbrede em estudos piloto de remoção de adesivos. Kryslaine Radomski realizou lesões cerebrais preliminares e cirurgias de transplante de células. Amanda Fu e Laura Tucker do laboratório central de estudos pré-clínicos do USU CNRM forneceram conselhos valiosos sobre cirurgias animais e testes de comportamento, respectivamente.
Materials
| 1 ml syringes | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
| 1.7 ml flip top test tubes | Denville | C2170 | |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide syringe needles | Becton Dickinson (BD) | 305122 | |
| 70% ethanol | Product of choice; varies by region | ||
| acetaminophen oral suspension | Tylenol (Children's) | Dilute to 1 mg/ml in water | |
| anesthetic vaporizer | Vetland | 521-11-22 | |
| animal handling cloth | Purchase from department store | ||
| Betadine | Purdue Products | NDC-67618-151-32 | |
| compressed oxygen | Product of choice; varies by region | ||
| cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| DAB staining kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| electrical tape | 3M Corporation | Purchase from department store | |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom Electric Co. | K.1070 – K.107018 | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Scientific | 60-1000 | |
| Impact One Stereotaxic Impactor for CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| lab bench timers | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Micropipette puller | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Any puller will suffice |
| Microscope cover slips | Fisherbrand | 12-545-E | |
| Microscope slide mounting medium | Product of choice | ||
| mirror | Purchase from department store | ||
| mouse anti-human nuclear antigen antibody | Millipore | MAB1281 | |
| Mouse on Mouse blocking kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| needle holder hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| ophthalmic ointment | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| ophthalmic spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| plastic box | Purchase from department store | ||
| plastic cylinder | Purchase from department store | ||
| QSI motorized syringe pump | Stoelting | 53311 | |
| Removable needle compression fitting | Hamilton | 55750-01 | |
| small rodent stereotaxic frame | Stoelting | 51925 | |
| small scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | A1110501 | |
| Sterile alcohol prep pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| sterile cotton swabs/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Sterile saline | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Stopwatches (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold microscope slides | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| sutures – 5.0 silk with curved needle | Oasis | MV-682 |
Riferimenti
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