Questo protocollo dimostra le metodologie per un modello murino di lesioni cerebrali traumatiche a cranio aperto e il trapianto di cellule derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane coltivate nel sito della lesione. Test comportamentali e istologici dei risultati di queste procedure sono descritti anche in breve.
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Articolo metodologico
Modello di impatto corticale controllato di lesioni cerebrali del topo con trapianto terapeutico di cellule neurali derivate da cellule staminali indotte dall'uomo
In questo articolo
Sommario
Abstract
La lesione cerebrale traumatica (TBI) è una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo. Patologia della malattia a causa di TBI progredisce dall'insulto meccanico primario ai processi di lesioni secondarie, tra cui apoptosi e infiammazione. La modellazione animale è stata preziosa nella ricerca di svelare i meccanismi di lesione e valutare potenziali terapie neuroprotettive. Questo protocollo descrive il modello di impatto corticale controllato (CCI) del TBI focale e a testa aperta. In particolare, vengono descritti i parametri per produrre una lieve lesione corticale unilaterale. Le conseguenze comportamentali del CCI vengono analizzate utilizzando il test di rimozione del nastro adesivo dell'integrazione sensoriale-continua bilaterale. Per quanto riguarda la terapia sperimentale per la patologia TBI, questo protocollo illustra anche un processo per il trapianto di cellule coltivate nel cervello. Le colture di cellule neurali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) sono state scelte per il loro potenziale per mostrare un ripristino funzionale superiore nei pazienti con TBI umana. La sopravvivenza cronica degli hiPSC nel tessuto cerebrale del topo ospite viene rilevata utilizzando un processo immunohistochimico DAB modificato.
Introduzione
Lesione cerebrale traumatica (TBI) è un termine generale per la lesione acquisita al cervello a causa di forze meccaniche indirette (accelerazione/decelerazione rotazionale o contro-colpo) da colpi alla testa o danni diretti da oggetti o onde di scoppio. La TBI è stata stimata essere la causa di circa il 9% dei decessi a livello mondiale e osservata in circa 50 milioni di casi all'anno1,2. Un rapporto del 2017 dei Centers for Disease Control and Prevention ha stimato che nel 2013 ci sono stati 2,8 milioni di visite ospedaliere e decessi dovuti a TBI negli Stati Uniti3. Molti TBI più lie....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti descritti in questo protocollo sono stati esaminati e approvati dall'Uniformed Services University Animal Care and Use Committee.
1. Craniectomia e impatto corticale controllato
- Preparazione del dispositivo a impatto corticale controllato e delle forniture chirurgiche.
- Caricare una siringa a punta di scivolamento da 1 mL con 0,5 mL di salina sterile per l'irrigazione delle ferite. Attaccare un ago da 25 G alla siringa per controllare l'irrigazione.
- Preparare una soluzione diluita della CsA in DMSO alla concentrazione finale di 1 mg/mL. Caricare una seconda siringa a punta di scivolamento da....
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Risultati
La chirurgia della craniectomia facilita la lesione cerebrale sperimentale e il trapianto di cellule terapeutiche: il modello di impatto corticale controllato della lesione cerebrale e la successiva terapia per il trapianto di cellule richiedono un'attenta rimozione del cranio sovrastante. La craniectomia può essere eseguita su qualsiasi superficie dorsale del cranio per consentire manipolazioni alla regione di interesse del cervello. Il diagramma in Figura 1 illustra uno sc.......
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Discussione
CCI mite come sistema modello per testare la terapia rigenerativa sperimentale
Il modello CCI è uno strumento prezioso per studiare i meccanismi di disfunzione tissutale dopo lesioni meccaniche alla corteccia. La sintonabilità dei parametri di lesione è una caratteristica interessante di questo modello. Alterare la profondità di impatto, la velocità o il tempo di dimora può aumentare o diminuire la gravità della lesione come desiderato dall'investigatore10,
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del Center for Neuroscience and Regenerative Medicine (CNRM, numero di sovvenzione G170244014). Apprezziamo l'assistenza di Mahima Dewan e Clara Selbrede negli studi pilota di rimozione adesiva. Kryslaine Radomski ha eseguito interventi chirurgici preliminari per il trapianto di cervello e trapianto di cellule. Amanda Fu e Laura Tucker del laboratorio centrale USU CNRM Preclinical Studies hanno fornito preziosi consigli rispettivamente su interventi chirurgici e test di comportamento per animali.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringhe da 1 ml | Becton Dickinson (BD) | ||
| 1,7 ml provette flip top | Denville | C2170 | |
| siringa da 10 microlitri | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide aghi per siringa | Becton Dickinson (BD) | ||
| 70% di etanolo | Prodotto a scelta; varia a seconda della regione | ||
| paracetamolo sospensione orale | Tylenol (per bambini) | Diluire a 1 mg/ml in acqua | |
| vaporizzatore per anestesia | Vetland | 521-11-22 | |
| panno | Acquisto dai grandi magazzini | ||
| Betadine | Purdue Prodotti | NDC-67618-151-32 | |
| ossigeno | Prodotto a scelta; varia in base alla regione | ||
| ciclosporina A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| Kit di colorazione DAB | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| dimetil solfossido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| anticorpo IgG anti-topo asino, HRP coniugato | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| nastro isolante | 3M Corporation | Acquisto da grandi magazzini | |
| pinzette fini | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| pinze | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| pipette capillari in vetro, diametro esterno 1 mm, ID | 0,58 mmWorld Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| Kit micromotore rotativo ad alta velocità | Foredom Electric Co. | K.1070 - K.107018 | |
| Ideal Micro Drill Fresa Set Di 5 | Punte Cellulari Scientific | 60-1000 | |
| Impact One Stereotaxic Impactor per CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| isoflurano | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| timer da banco da laboratorio | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Estrattore per micropipette | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Qualsiasi estrattore sarà sufficiente |
| Vetrini coprimicroscopio | Fisherbrand | 12-545-E | |
| Supporto di montaggio | Prodotto di scelta | ||
| specchio | Acquisto dal grande magazzino | ||
| Topo anticorpo antigene nucleare umano | Anticorpo Millipore | MAB1281 | |
| Mouse on Mouse Kit di blocco | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| porta-aghi emostatico | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| unguento oftalmico | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| forbici a molla oftalmica | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| scatola | Acquista dal cilindro | ||
| di plastica | Acquisto dal grande magazzino | ||
| Pompa a siringa motorizzata QSI | Stoelting | 53311 | |
| Raccordo a compressione con ago rimovibile | Hamilton | 55750-01 | |
| piccolo telaio stereotassico per roditori | Stoelting | 51925 | |
| piccole forbici | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | ||
| Tamponi sterili per la preparazione dell'alcol | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| tamponi di cotone sterili/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Soluzione salina sterile | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Cronometri (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold vetrini per microscopio | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| suture - seta 5.0 con ago curvo | Oasis | MV-682 |
Riferimenti
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Murray, C. J., et al.
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Ristampe e permessi
