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Ambiente

N2Oへの逐次変換による14NH4+/154+ 1415NH4++分析に基づくアンモニウムへの非シミラトリー硝酸還元の電位率の測定

Published: October 07, 2020
doi:
10.3791/59562
, , , , , ,
1Department of Biological Sciences, Faculty of Science and Engineering,Chuo University, 2Faculty & Graduate School of Urban Environmental Sciences,Tokyo Metropolitan University, 3Center for Ecological Research,Kyoto University, 4Department of Chemistry, Faculty of Science,Toho University, 5Graduate School of Integrated Arts and Sciences,Hiroshima University

Summary

144NH4+/15 1415NH4++分析に基づいて潜在的なDNRA率を決定する一連の方法が詳細に提供される。+NH4++は、数ステップでN2Oに変換され、四重極ガスクロマトグラフィー-質量分析を用いて分析されます。

Abstract

地球から水生生態系に移されたN種の主3−な窒素である硝酸塩の運命を理解することの重要性は、工業化後に世界的な窒素負荷が劇的に増加したため、増加しています。アンモニウム(DNRA)への不シミラトリー硝酸塩の減少および脱窒は、両方ともNO3を使用する微生物プロセスである – 呼吸のために。脱窒と比較して、DNRA活性の定量的決定は限られた範囲でのみ行われてきた。これはNO3変換におけるDNRAの重要性とこのプロセスの調節要因の理解を十分にするに至った。本稿の目的は、環境試料中の潜在的なDNRA率の測定に関する詳細な手順を提供することにある。簡単に言えば、潜在的なDNRA率は、15NO3の15N標識アンモニウム(15NH4+)蓄積率から計算することができる–インキュベーションを加えた。4本論文に記載した14NH4+及び4+15NH4+濃度の判定は、以下の工程から構成される。4 まず、試料中のNH4++を抽出し、アンモニウム塩として酸性化ガラスフィルターに捕閉する。第二に、閉じ込められたアンモニウムは溶出し、過硫酸酸化を介してNO3に酸化される。第三に、NO3−はN2 O還元性デミターゼ欠乏樹を介してN2Oに変換される。2最後に、変換されたN2Oを、以前に開発した四極性ガスクロマトグラフィー質量分析システムを用いて分析する。この方法を塩沼堆積物に適用し、その潜在的なDNRA率を計算し、提案された手順が前述の方法と比較して簡単かつ迅速な決定を可能にすることを実証した。

Introduction

窒素肥料の人工合成とその広く普及した用途は、世界の窒素サイクルを大きく乱しています。陸上から沿岸システムへの反応性窒素の移動は、工業前の時代1から倍増していると推定される。特定の分野に適用される肥料のかなりの部分は、主にNO3– 2として、土壌から河川や地下水に洗い流されます。これは、飲料水汚染、富栄養化、低酸素症の形成などの環境問題を引き起こす可能性があります。NO3–水環境では、生物学的同化および様々な微生物の崩壊プロセスを介して生態系から除去または保持されます。脱窒とアナモックスはNO 3の主要な微生物除去プロセスであることが知られている3–.脱窒はNO3の微生物還元−ガスN製品(NO、N2O、N2)2と有機物などの電子2ドナーの酸化と相まって、上記の問題のリスクを低減する。アナモックスはまた、NO2からN2を生成する –とNH4+;したがって、生態系から無機Nを除去します。逆に、DNRAは生態系の中でNを保持するために働きます。DNRAは、主に発酵細菌またはケモリトオート栄養菌によって行われ、それらが不シミシ素性NO3を減少させることが一般的に受け入れられている- 生体利用可能で少ない移動式NH4+.

DNRAに関する研究は、海洋または河口堆積物や水、塩または汽水湿原土壌、マングローブ土壌などの海洋または河口生態系で主に行われてきた。沿岸生態系または海洋生態系は、陸上生態系からNO,12,,,3-除去のための貯水池として重要であり、以前の研究ではDNRAは、NO3–除去(0-99%)3、4、5、6、7、8、9、10、11、16、13、14、15、16、18の非常に広い範囲にわたって貢献することが示4,5,6,716,1715,13,14,,10,118,9されています。3,また、DNRAの存在は、淡水環境19、水田土20、林土21など幅広い環境で実証されている。これらの研究は、DNRAがNO3-−除去の脱窒に匹敵する可能性があることを示しているが、DNRA活性を測定する研究は、脱窒を測定するものに比べて依然として非常に限られている。

DNRAレートは、解析モデルまたは数値モデルを使用したデータ解析と組み合わせて、15のNラベル技術を使用して評価されています。DNRAレートを計算する1つの分析ソリューションは、トレーサーとして15NO3を追加した後のNH4++プールの15N濃縮の増加に基づいています。15NラベルNO3–サンプルに添加され、インキュベートされ、DNRA率は、一定期間の前後にNH4++の濃度および同位体比の変化から計算することができます。本論文では、DNRA率の計算に必要なNH4++濃度と同位体比を定量化する方法について詳しく説明する。基本的に、ここで報告される方法は、いくつかの手順に追加された修正を加えたいくつかの以前に報告されたテクニック22、23、24、25、2624,25,26の組み合わせです。22,23この方法は、一連の5つの成分手順で構成される:(1)安定同位体トレーサーの修正による環境試料のインキュベーション3、15NO3−、(2)NH4の4抽出と回収を改変した「拡散手順」を用いて、(3)試料中のNH4++過硫酸酸化、 先住民族のNH34+および15NH4++からなるDNRA活性を介して、NO3–および15NO3−、(4)その後の微生物変換NO33-−および15NO3-−修飾された樹木化法を介したN2Oアイソトポマー、および(5)ガスクロマトグラフィーを用いたN2Oイソトポマーの定量化(GC/MS/MS/GCrome)以降のセクションでは、まず、手順(2)と(4)の準備について説明し、次に、5つのコンポーネントの手順をすべて詳細に説明します。

Protocol

1. 気体NH3を定量的に捕捉するためのPTFEエンベロープの調製 60mmのポリテトラフルオロエチレン(PTFE)テープ(幅25mm)を小さなアルミニウム箔(約300mm x 450mmの大きさ、エタノールで拭く)に貼ります。 450 °Cで450°Cで4時間、マフレ炉でガラス繊維フィルター(直径10mm、直径2.7μm)をアッシュします。ガラス繊維フィルターをテープの長軸の中間点の少し上に置きます(<strong class="xf…

Representative Results

本論文で発表された代表的な結果は、塩沼堆積物の 15のN-トレーシング実験から導出された。サンプリングされた塩沼は、2011年の東日本大震災の後、宮城県気仙沼市のMoune地区で新たに作られました。2017年9月、亜潮帯と潮間帯の2つの場所で、表面堆積物(0~3cm)が採取されました。まず、採取直後に、堆積物を4mmメッシュでふるいに入れ、植物の根、貝殻の破?…

Discussion

DNRA分析のためのNH4++の濃度および同位体比は、いくつかの方法を用いて定量した。NH4++の濃度と同位体比は、一般に個別に測定される。NH4+濃度は、通常、オートアナライザ4、10、15、16、1710,15,16を含む色分け法を17使用して測定されます。<…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

田中直人氏のデータ収集とプロトコルの開発に感謝します。サンプルのコレクションは、JSPS KAKENHIグラント番号17K15286によってサポートされました。

Materials

15N-KNO3 SHOKO SCIENCE N15-0197
15N-NH4Cl SHOKO SCIENCE N15-0034
20 mL PP bottle SANPLATEC 61-3210-18 Wide-mouth
Aluminum cap Maruemu 1307-13 No. 20, with hole
Boric acid Wako 021-02195
Centrifuge HITACHI Himac CR21G II
Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector SANSIN INDUSTRIAL IP-12
Disposable cellulose acetate membrane filter ADVANTEC 25CS020AS Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter
Disposable syringe Termo SS-10SZ 10 mL
Disposable syringe Termo SS-01T 1 mL
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) NISSUI PHARMACEUTICAL 5913
Gastight syringe VICI Valco Instruments 4075-15010 Series A-2, 100 µL
GC/MS shimadzu GCMS-QP2010ultra
GF/D Whatman 1823-010 10 mm in diameter
Glass vial Maruemu 0501-06 20 mL
Gray butyl rubber stopper Maruemu 1306-03 No.20-S
H2SO4 Wako 192-04696 Guaranteed Reagent
K2S2O8 Wako 169-11891 Nitrogen and Phosphorus analysis grade
KCl Wako 163-03545 Guaranteed Reagent
KNO3 Wako 160-04035 Guaranteed Reagent
NaOH Wako 191-08625 Nitrogen compounds analysis grade
NH4Cl Wako 017-02995 Guaranteed Reagent
Plastic centrifuge tube ASONE 1-3500-22 50 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens American Type Culture Collection (ATCC) ATCC 13985 Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens
PTFE sealing tape Sigma-Aldrich Z221880 25 mm in width
Reciprocating shaker TAITEC 0000207-000 NR-10
Screw-cap test tube IWAKI 84-0252 11 mL
PTFE-lined cap for test tube IWAKI 84-0262
Tryptic Soy Broth Difco Laboratories 211825
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Riferimenti

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Kuroiwa, M., Fukushima, K., Hashimoto, K., Senga, Y., Sato, T., Katsuyama, C., Suwa, Y. Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O. J. Vis. Exp. (164), e59562, doi:10.3791/59562 (2020).
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