Mätning av de Dissimilatory Nitratminskningens potentiella frekvenser till ammonium Baserat på 14NH4+/15NH4+ Analyser via Sekventiell omvandling till N2O
Summary
En serie metoder för att fastställa den potentiella DNRA-frekvensen baserat på 14NH4+/15NH4+ analyser tillhandahålls i detalj. NH4+ omvandlas till N2O via flera steg och analyseras med hjälp av quadrupole gaskromatografi–masspektrometri.
Abstract
Vikten av att förstå nitrats öde (NO3−), som är den dominerande N-arten som överförs från terrestra till akvatiska ekosystem, har ökat eftersom de globala kvävebelastningarna har ökat dramatiskt efter industrialiseringen. Dissimilerande nitratreduktion till ammonium (DNRA) och denitrifikation är båda mikrobiella processer som använder NO3− för respiration. Jämfört med denitrifikationen har kvantitativa bestämningar av DNRA-verksamheten endast genomförts i begränsad omfattning. Detta har lett till en otillräcklig förståelse för DNRA:s betydelse i NO3− transformationer och de reglerande faktorerna i denna process. Målet med detta dokument är att tillhandahålla ett detaljerat förfarande för mätning av den potentiella DNRA-satsen i miljöprover. I korthet kan den potentiella DNRA-takten beräknas från den 15N-märkta ammonium (15NH4+) ackumulationshastighet i 15NO3− tillsatt inkubation. Fastställandet av de 14NH4+ och 15NH4+ koncentrationer som beskrivs i detta dokument består av följande steg. Först extraheras NH4+ i provet och fastnar på ett surt glasfilter som ammoniumsalt. För det andra eluteras och oxideras den fångade ammonium till NO3− via persulfatoxidation. För det tredje omvandlas NO3− till N2O via en N2O-reduktas-bristfällig denitrifier. Slutligen analyseras den konverterade N2O med hjälp av en tidigare utvecklad quadrupole gaskromatografi–masspektrometri system. Vi tillämpade denna metod på saltkärrsediment och beräknade deras potentiella DNRA-satser, vilket visar att de föreslagna förfarandena möjliggör en enkel och snabbare bestämning jämfört med tidigare beskrivna metoder.
Introduction
Den artificiella syntesen av kvävegödselmedel och dess utbredda tillämpning har kraftigt stört den globala kvävecykeln. Man uppskattar att överföringen av reaktivt kväve från land- till kustsystem har fördubblats sedan förindustriella tider1. En betydande del av gödselmedel som tillämpas på ett visst fält tvättas bort från jorden till floder eller grundvatten, främst som NO3− 2. Detta kan orsaka miljöproblem såsom dricksvattenföroreningar, övergödning, och bildandet av hypoxi. NO3− i vattenmiljöer avlägsnas från eller behålls i ekosystemet via biologisk assimilering och olika mikrobiella dissimilatoriska processer. Denitrification och anammox är kända för att vara stora mikrobiella borttagningsprocesser för NO3−. Denitrifikation är den mikrobiella reduktionen på NO3− till gasformiga N-produkter (NO, N2O, och N2) i kombination med oxidation av en elektrondonator, såsom organiska ämnen, och därigenom minska risken för de ovan nämnda problemen. Anammox producerar också N2 från NO2− och NH4+; därför tar den bort oorganiskt N från ett ekosystem. Omvänt arbetar DNRA för att behålla N i ett ekosystem; det är allmänt accepterat att DNRA utförs främst av fermentativa bakterier eller kemolithoautotrofa bakterier och att de minskar dissimilatoriska NO3− till biotillgängliga och mindre rörliga NH4+.
Studier på DNRA har främst utförts i marina eller flodmynningsekosystem, såsom oceaniska eller flodmynningssediment och vatten, salt eller bräckt kärr jord, och mangrove jord. Kust- eller havsekosystem är viktiga som reservoarer för att avlägsnaNO 3− från terrestra ekosystem, och i tidigare studier har DNRA visats bidra över ett mycket brett spektrum av NO3− borttagning (0–99%)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Vidare har förekomsten av DNRA visats i ett brett spektrum av miljöer inklusive sötvatten miljöer19, ris paddy jordar20, och skogsjordar21. Medan dessa studier har visat att DNRA är potentiellt jämförbart med denitrifikation för NO3− borttagning, är studier som mäter DNRA-aktiviteten fortfarande mycket begränsade jämfört med dem som mäter denitrifikation.
DNRA-frekvensen har utvärderats med hjälp av 15N-märkningstekniker i samband med dataanalys via analytiska eller numeriska modeller. En analytisk lösning för att beräkna DNRA-räntan baseras på ökningen av 15N-anrikningen av NH4+ poolen efter tillsats av 15NO3− som spårämne. 15 år N-märkt NO3− läggs till ett prov och inkuberas, och DNRA-satsen kan sedan beräknas utifrån koncentrations- och isotopkvotens förändringar i NH4+ före och efter en viss tidsperiod. I detta dokument beskrivs en metod för att kvantifiera NH4+ -koncentrationen och isotopförhållandet, som krävs för att beräkna DNRA-satsen, i detalj. I grund och botten, den metod som rapporteras här är en kombination av flera tidigare rapporteradetekniker 22,23,24,25,26 med ändringar läggas till vissa förfaranden. Metoden består av en serie av fem komponentförfaranden: (1) inkubering av ett miljöprov med ändring av en stabil isotopspårare, 15NO3−, (2) utvinning och återvinning av NH4+ med hjälp av ett “diffusionsförfarande” med ändringar, (3) persulfat oxidation av NH4+ i provet, bestående av inhemska NH4+och 15NH4+ som härrör från 15NO3− via DNRA-aktivitet, till NO3− och 15NO3−, (4) efterföljande mikrobiell omvandling av NO3− och 1 15NO3− till N2O isotopomerer via den modifierade denitrifiermetoden, och (5) kvantifiering av N2O-isotopomerna med hjälp av gaskromatografi–masspektrometri (GC/MS). I följande avsnitt beskrivs först förberedelserna för förfarandena (2) och (4) och därefter beskrivs därefter alla fem komponentförfarandena i detalj.
Protocol
Representative Results
Discussion
Koncentrationen och isotopförhållandet av NH4+ för DNRA-analysen kvantifierades med hjälp av flera metoder. Koncentrationerna och isotopkvoterna på NH4+ mäts i allmänhet separat. Koncentrationen NH4+ mäts typiskt med hjälp av koloromiska metoder inklusive en autoanalyzer4,10,15,16,17. I…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Naoto Tanaka för att ha hjälpt till att datainsamling och utveckla protokollet. Insamlingen av prover stöddes av JSPS KAKENHI Grant Number 17K15286.
Materials
| 15N-KNO3 | SHOKO SCIENCE | N15-0197 | |
| 15N-NH4Cl | SHOKO SCIENCE | N15-0034 | |
| 20 mL PP bottle | SANPLATEC | 61-3210-18 | Wide-mouth |
| Aluminum cap | Maruemu | 1307-13 | No. 20, with hole |
| Boric acid | Wako | 021-02195 | |
| Centrifuge | HITACHI | Himac CR21G II | |
| Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector | SANSIN INDUSTRIAL | IP-12 | |
| Disposable cellulose acetate membrane filter | ADVANTEC | 25CS020AS | Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter |
| Disposable syringe | Termo | SS-10SZ | 10 mL |
| Disposable syringe | Termo | SS-01T | 1 mL |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) | NISSUI PHARMACEUTICAL | 5913 | |
| Gastight syringe | VICI Valco Instruments | 4075-15010 | Series A-2, 100 µL |
| GC/MS | shimadzu | GCMS-QP2010ultra | |
| GF/D | Whatman | 1823-010 | 10 mm in diameter |
| Glass vial | Maruemu | 0501-06 | 20 mL |
| Gray butyl rubber stopper | Maruemu | 1306-03 | No.20-S |
| H2SO4 | Wako | 192-04696 | Guaranteed Reagent |
| K2S2O8 | Wako | 169-11891 | Nitrogen and Phosphorus analysis grade |
| KCl | Wako | 163-03545 | Guaranteed Reagent |
| KNO3 | Wako | 160-04035 | Guaranteed Reagent |
| NaOH | Wako | 191-08625 | Nitrogen compounds analysis grade |
| NH4Cl | Wako | 017-02995 | Guaranteed Reagent |
| Plastic centrifuge tube | ASONE | 1-3500-22 | 50 mL, VIO-50BN |
| Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 13985 | Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens |
| PTFE sealing tape | Sigma-Aldrich | Z221880 | 25 mm in width |
| Reciprocating shaker | TAITEC | 0000207-000 | NR-10 |
| Screw-cap test tube | IWAKI | 84-0252 | 11 mL |
| PTFE-lined cap for test tube | IWAKI | 84-0262 | |
| Tryptic Soy Broth | Difco Laboratories | 211825 |
Riferimenti
- Gruber, N., Galloway, J. N. An Earth-system perspective of the global nitrogen cycle. Nature. 451 (7176), 293-296 (2008).
- Galloway, J. N., et al. The Nitrogen Cascade. Bioscience. 53 (4), 341-356 (2003).
- Rysgaard, S., Risgaard-Petersen, N., Sloth, N. P., Caumette, P., Castel, J., Herbert, R. Nitrification, denitrification, and nitrate ammonification in sediments of two coastal lagoons in Southern France. Coastal Lagoon Eutrophication and Anaerobic Processes (C.L.E.AN.). Developments in Hydrobiology. 117, 133-141 (1996).
- Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms. Aquatic Microbial Ecology. 21, 73-84 (2000).
- Tobias, C. R., Anderson, I. C., Canuel, E. A., Macko, S. A. Nitrogen cycling through a fringing marsh-aquifer ecotone. Marine Ecology Progress Series. 210, 25-39 (2001).
- An, S. M., Gardner, W. S. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) as a nitrogen link, versus denitrification as a sink in a shallow estuary (Laguna Madre/Baffin Bay, Texas). Marine Ecology Progress Series. 237, 41-50 (2002).
- Gardner, W. S., et al. Nitrogen fixation and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) support nitrogen dynamics in Texas estuaries. Limnology & Oceanography. 51 (1), 558-568 (2006).
- Preisler, A., et al. Biological and chemical sulfide oxidation in a Beggiatoa inhabited marine sediment. The ISME Journal. 1 (4), 341-353 (2007).
- Gardner, W. S., McCarthy, M. J. Nitrogen dynamics at the sediment-water interface in shallow, sub-tropical Florida Bay: why denitrification efficiency may decrease with increased eutrophication. Biogeochemistry. 95 (2-3), 185-198 (2009).
- Dong, L. F., et al. Changes in benthic denitrification, nitrate ammonification, and anammox process rates and nitrate and nitrite reductase gene abundances along an estuarine nutrient gradient (the Colne estuary, United Kingdom). Applied and Environmental Microbiology. 75 (10), 3171-3179 (2009).
- Koop-Jakobsen, K., Giblin, A. E. The effect of increased nitrate loading on nitrate reduction via denitrification and DNRA in salt marsh sediments. Limnology & Oceanography. 55 (2), 789-802 (2010).
- Dong, L. F., et al. Dissimilatory reduction of nitrate to ammonium, not denitrification or anammox, dominates benthic nitrate reduction in tropical estuaries. Limnology & Oceanography. 56 (1), 279-291 (2011).
- Fernandes, S. O., Bonin, P. C., Michotey, V. D., Garcia, N., LokaBharathi, P. A. Nitrogen-limited mangrove ecosystems conserve N through dissimilatory nitrate reduction to ammonium. Scientific Reports. 2, 419 (2012).
- Behrendt, A., de Beer, D., Stief, P. Vertical activity distribution of dissimilatory nitrate reduction in coastal marine sediments. Biogeosciences. 10 (11), 7509-7523 (2013).
- Song, G. D., Liu, S. M., Marchant, H., Kuypers, M. M. M., Lavik, G. Anammox denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in the East China Sea sediment. Biogeosciences. 10 (11), 6851-6864 (2013).
- Yin, G., Hou, L., Liu, M., Liu, Z., Gardner, W. S. A novel membrane inlet mass spectrometer method to measure 15NH4+15+ for isotope-enrichment experiments in aquatic ecosystems. Environmental Science & Technology. 48 (16), 9555-9562 (2014).
- Zheng, Y., et al. Tidal pumping facilitates dissimilatory nitrate reduction in intertidal marshes. Scientific Reports. 6, 21338 (2016).
- Bu, C., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium in the Yellow River Estuary: Rates, Abundance, and Community Diversity. Scientific Reports. 7, 6830 (2017).
- Scott, J. T., McCarthy, M. J., Gardner, W. S., Doyle, R. D. Denitrification, dissimilatory nitrate reduction to ammonium, and nitrogen fixation along a nitrate concentration gradient in a created freshwater wetland. Biogeochemistry. 87 (1), 99-111 (2008).
- Shan, J., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction Processes in Typical Chinese Paddy Soils: Rates, Relative Contributions, and Influencing Factors. Environmental Science & Technology. 50 (18), 9972-9980 (2016).
- Silver, W. L., Herman, D. J., Firestone, M. K. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium in upland tropical forest soils. Ecology. 82 (9), 2410-2416 (2001).
- Holmes, R. M., McClelland, J. W., Sigman, D. M., Fry, B., Peterson, B. J. Measuring 15N–NH4+ in marine, estuarine and fresh waters: An adaption of the ammonia diffusion method for samples with low ammonium concentrations. Marine Chemistry. 60 (3-4), 235-243 (1998).
- Sigman, D. M., et al. A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater. Analytical Chemistry. 73 (17), 4145-4153 (2001).
- Weigand, M. A., Foriel, J., Barnett, B., Oleynik, S., Sigman, D. M. Updates to instrumentation and protocols for isotopic analysis of nitrate by the denitrifier method. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (12), 1365-1383 (2016).
- Isobe, K., et al. Analytical techniques for quantifying 15N/14N of nitrate, nitrite, total dissolved nitrogen and ammonium in environmental samples using a gas chromatograph equipped with a quadrupole mass spectrometer. Microbes and Environments. 26 (1), 46-53 (2011).
- Miyajima, T., Tanaka, Y., Koile, Y. Determining 15N enrichment of dissolved organic nitrogen in environmental waters by gas chromatography/negative-ion chemical ionization mass spectrometry. Limnology and Oceanography. 3 (3), 164-173 (2005).
- Stevens, R. J., Laughlin, R. J., Burns, L. C., Arah, J. R. M., Hood, R. C. Measuring the contributions of nitrification and denitrification to the flux of nitrous oxide from soil. Soil Biology and Biochemistry. 29 (2), 139-151 (1997).
- Porubsky, W. P., Velasquez, L. E., Joye, S. B. Nutrient-replete benthic microalgae as a source of dissolved organic carbon to coastal waters. Estuaries and Coasts. 31 (5), 860-876 (2008).
- Huygens, D., et al. Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils. Nature Geoscience. 1 (8), 543-548 (2008).
- Rutting, T., Boeckx, P., Muller, C., Klemedtsson, L. Assessment of the importance of dissimilatory nitrate reduction to ammonium for the terrestrial nitrogen cycle. Biogeosciences. 8 (7), 1779-1791 (2011).
- Song, B., Lisa, J. A., Tobias, C. R. Linking DNRA community structure and activity in a shallow lagoonal estuarine system. Frontiers in Microbiology. 5, 460 (2014).
- Cheng, L., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes in sediments of urban river networks: Spatiotemporal variations and environmental implications. Environmental Pollution. 219, 545-554 (2016).
- Lisa, J. A., Song, B., Tobias, C. R., Hines, D. E. Genetic and biogeochemical investigation of sedimentary nitrogen cycling communities responding to tidal and seasonal dynamics in Cape Fear River Estuary. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 167, A313-A323 (2015).
- Deng, F. Y., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes and associated contribution to nitrogen removal in sediments of the Yangtze Estuary. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 120 (8), 1521-1531 (2015).
- Tiedje, J. M., Zehnder, A. J. B. . Biology of Anaerobic Microorganisms. , 179-244 (1988).
- Tiedje, J. M., Sexstone, A. J., Myrold, D. D., Robinson, J. A. Denitrification: ecological niches, competition and survival. Antonie van Leeuwenhoek. 48, 569-583 (1982).
- Hardison, A. K., Algar, C. K., Giblin, A. E., Rich, J. J. Influence of organic carbon and nitrate loading on partitioning between dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) and N2 production. Geochimica et Cosmochimica Acta. , 164 (2015).
- Sigman, D. M., et al. Natural abundance-level measurement of the nitrogen isotopic composition of oceanic nitrate: an adaptation of the ammonia diffusion method. Marine Chemistry. 57 (3-4), 227-242 (1997).
- Risgaard-Petersen, N., Rysgaard, S., Revsbech, N. P. Combined microdiffusion-hypobromite oxidation method for determining nitrogen-15 isotope in ammonium. Soil Science Society of America Journal. 59 (4), (1995).
- Gardner, W. S., Bootsma, H. A., Evans, C., John, P. A. S. Improved chromatographic analysis of 15N:14N ratios in ammonium or nitrate for isotope addition experiments. Marine Chemistry. 48 (3-4), 271-282 (1995).
