Messung der potenzialimilatorischen Nitratreduktion zu Ammonium basierend auf 14NH4+/15NH4+ Analysen mittels Sequenzielle Umwandlung in N 2O

Summary

Eine Reihe von Methoden zur Bestimmung der potentiellen DNRA-Rate auf Basis von ¹⁴NH₄⁺/¹⁵NH₄⁺ Analysen wird detailliert bereitgestellt. NH₄⁺ wird über mehrere Schritte in N₂O umgewandelt und mittels Quadrupol-Gaschromatographie–Massenspektrometrie analysiert.

Abstract

Die Bedeutung des Verständnisses des Schicksals von Nitrat (NO₃^),dem dominanten N-Arten, das von terrestrischen auf aquatische Ökosysteme übertragen wird, hat zugenommen, weil die globalen Stickstoffbelastungen nach der Industrialisierung dramatisch zugenommen haben. Die dissimilatorische Nitratreduktion auf Ammonium (DNRA) und Denitrifikation sind beide mikrobiellen Prozesse, die NO₃^– zur Atmung verwenden. Im Vergleich zur Denitrifikation wurden quantitative Untersuchungen der DNRA-Aktivität nur in begrenztem Umfang durchgeführt. Dies hat zu einem unzureichenden Verständnis der Bedeutung von DNRA in NO₃^{–Transformationen} und den regulierenden Faktoren dieses Prozesses geführt. Ziel dieses Papiers ist es, ein detailliertes Verfahren zur Messung des potenziellen DNRA-Wertes in Umweltproben bereitzustellen. Kurz gesagt, kann die potentielle DNRA-Rate aus der ¹⁵N-markierten Ammonium (¹⁵NH₄⁺) Akkumulationsrate in ¹⁵NO₃berechnet werden^. Die Bestimmung der in diesem Papier beschriebenen Konzentrationen ¹⁴NH₄⁺ und ¹⁵NH₄⁺ besteht aus den folgenden Schritten. Zunächst wird das NH₄⁺ in der Probe extrahiert und auf einem gesäuerten Glasfilter als Ammoniumsalz eingeschlossen. Zweitens wird das eingeschlossene Ammonium eluiert und über Persulfatoxidation zu NO₃^– oxidiert. Drittens wird das NO₃^– über einen N 2 O-Reduktase-Mangel denitrifier in N₂O umgewandelt.₂ Schließlich wird das umgebaute N₂O mit einem zuvor entwickelten Quadrupol-Gaschromatographie-Massenspektrometriesystem analysiert. Wir wandten diese Methode auf Salzsumpfsedimente an und berechneten deren potenzielle DNRA-Raten, was zeigt, dass die vorgeschlagenen Verfahren eine einfache und schnellere Bestimmung im Vergleich zu zuvor beschriebenen Methoden ermöglichen.

Introduction

Die künstliche Synthese von Stickstoffdünger und seine weit verbreitete Anwendung haben den globalen Stickstoffkreislauf stark gestört. Es wird geschätzt, dass sich der Transfer von reaktivem Stickstoff von terrestrischen zu Küstensystemen seit den vorindustriellen Zeiten¹verdoppelt hat. Ein erheblicher Teil der Düngemittel, die auf ein bestimmtes Feld aufgebracht werden, wird vom Boden zu Flüssen oder Grundwasser abgewaschen, in erster Linie als NO₃^{x 2}. Dies kann zu Umweltproblemen wie Trinkwasserverschmutzung, Eutrophierung und Hypoxiebildung führen. NO₃^– in Wasserumgebungen wird durch biologische Assimilation und verschiedene mikrobielle dissimilatorische Prozesse aus dem Ökosystem entfernt oder zurückgehalten. Denitrifikation und Anammox sind bekannt, dass wichtige mikrobielle Entfernungsprozesse für NO₃^. Die Denitrifikation ist die mikrobielle Reduktion von NO₃^auf gasförmige N-Produkte (NO,_N2O und_N2) in Verbindung mit der Oxidation eines Elektronenspenders, wie organischesubstanzen, wodurch das Risiko der oben genannten Probleme verringert wird. Anammox produziert auch N₂ aus NO₂^und NH₄⁺; daher entfernt es anorganisches N aus einem Ökosystem. Umgekehrt arbeitet die DNRA daran, N in einem Ökosystem zu erhalten; es ist allgemein anerkannt, dass DNRA hauptsächlich durch fermentative Bakterien oder chemolithoautotrophe Bakterien durchgeführt wird und dass sie dissimilatorische NO₃^– auf bioverfügbar und weniger mobile NH₄⁺reduzieren und reduzieren.

Studien über DNRA wurden hauptsächlich in marinen oder mündungsischen Ökosystemen wie ozeanischen oder mündungsigen Sedimenten und Wasser, Salz- oder Brackwiesenböden und Mangrovenböden durchgeführt. Küsten- oder Meeresökosysteme sind wichtig als Reservoirs für die Entfernung von NO₃^aus terrestrischen Ökosystemen, und in früheren Studien hat sich gezeigt, dass DNRA über einen sehr breiten Bereich von NO₃beitragen –^Entfernung (0–99%)^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18}. Darüber hinaus wurde die Existenz von DNRA in einer Vielzahl von Umgebungen nachgewiesen, einschließlich Süßwasserumgebungen¹⁹,^{ReisrohreBöden 20}und Waldböden²¹. Während diese Studien gezeigt haben, dass DNRA potenziell mit der Denitrifikation für NO₃^{–Entfernung} vergleichbar ist, sind Studien zur Messung der DNRA-Aktivität im Vergleich zu denen, die die Denitrifikation messen, immer noch sehr begrenzt.

Die DNRA-Rate wurde mit ¹⁵N-Labeling-Techniken in Verbindung mit der Datenanalyse mittels analytischer oder numerischer Modelle ausgewertet. Eine analytische Lösung zur Berechnung der DNRA-Rate basiert auf der Erhöhung der ¹⁵N-Anreicherung des NH₄⁺ Pools nach dem Hinzufügen von ¹⁵NO₃^– als Tracer. ¹⁵ N-labeled NO₃^– wird einer Probe hinzugefügt und inkubiert, und die DNRA-Rate kann dann aus den Konzentrations- und Isotopenverhältnisänderungen in NH₄⁺ vor und nach einem bestimmten Zeitraum berechnet werden. In diesem Papier wird eine Methode zur Quantifizierung der NH₄⁺ Konzentration und des Isotopenverhältnisses, die zur Berechnung der DNRA-Rate erforderlich sind, ausführlich beschrieben. Grundsätzlich ist die hier beschriebene Methode eine Kombination aus mehreren zuvor gemeldeten Techniken^{22,23,24,25,26} mit Änderungen, die einigen Prozeduren hinzugefügt wurden. Das Verfahren besteht aus einer Reihe von fünf Komponentenverfahren: (1) Inkubation einer Umweltprobe mit der Änderung eines stabilen Isotopentracers, ¹⁵NO₃^,(2) Extraktion und Rückgewinnung von NH₄⁺ unter Verwendung eines “Diffusionsverfahrens” mit Modifikationen, (3) Persulfatoxidation von NH₄⁺ in der Probe, bestehend aus einheimischen NH₄⁺ und ¹⁵NH₄⁺ abgeleitet von ¹⁵NO₃^– über DNRA-Aktivität, in NO₃^{und 15}NO₃^,(4) nachfolgende mikrobielle Transformation von NO₃^{und 15}NO₃^– zu_N2O Isotopomern über die modifizierte Denitrifiermethode und (5) Quantifizierung der N₂O Isotopomere mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC/MS). Im folgenden Abschnitt wird zunächst die Vorbereitung der Verfahren (2) und (4) beschrieben und anschließend alle fünf Komponentenverfahren ausführlich beschrieben.

Protocol

1. Erstellung eines PTFE-Umschlags zur quantitativen Erfassung gasförmiger NH3 Legen Sie ein 60-mm-Stück Polytetrafluorethylen (PTFE) (25 mm Breite) auf eine kleine Folie aus Aluminiumfolie (ca. 300 mm x 450 mm groß, mit Ethanol abgewischt). Asche ein Glasfaserfilter (10 mm Durchmesser mit einer Porengröße von 2,7 m) bei 450 °C für 4 h in einem Muffelofen. Legen Sie den Glasfaserfilter etwas über dem Mittelpunkt der längeren Achse des Bandes (Abbildung 1a</stro…

Representative Results

Die repräsentativen Ergebnisse, die in diesem Papier vorgestellt werden, stammen aus 15N-Tracing-Experimenten von Salzsumpfsedimenten. Der salzbeprobte Salzmarsch wurde nach dem Großen Erdbeben in Ostjapan 2011 im Moune-Gebiet der Stadt Kesen-numa in der Präfektur Miyagi in Japan neu geschaffen. Im September 2017 wurden an zwei Stellen in den Untergezeiten- und Gezeitenzonen Oberflächensedimente (0–3 cm) gesammelt. Zuerst wurde das Sediment unmittelbar nach der Sammlung d…

Discussion

Die Konzentration und das Isotopenverhältnis von NH₄⁺ für die DNRA-Analyse wurden mit mehreren Methoden quantifiziert. Die Konzentrationen und Isotopenverhältnisse von NH₄⁺ werden in der Regel getrennt gemessen. Die NH₄⁺ Konzentration wird in der Regel mit kolorimetrischen Methoden einschließlich eines Autoanalyzers^4,10,15,16…

Materials

15N-KNO3	SHOKO SCIENCE	N15-0197
15N-NH4Cl	SHOKO SCIENCE	N15-0034
20 mL PP bottle	SANPLATEC	61-3210-18	Wide-mouth
Aluminum cap	Maruemu	1307-13	No. 20, with hole
Boric acid	Wako	021-02195
Centrifuge	HITACHI	Himac CR21G II
Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector	SANSIN INDUSTRIAL	IP-12
Disposable cellulose acetate membrane filter	ADVANTEC	25CS020AS	Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter
Disposable syringe	Termo	SS-10SZ	10 mL
Disposable syringe	Termo	SS-01T	1 mL
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-)	NISSUI PHARMACEUTICAL	5913
Gastight syringe	VICI Valco Instruments	4075-15010	Series A-2, 100 µL
GC/MS	shimadzu	GCMS-QP2010ultra
GF/D	Whatman	1823-010	10 mm in diameter
Glass vial	Maruemu	0501-06	20 mL
Gray butyl rubber stopper	Maruemu	1306-03	No.20-S
H2SO4	Wako	192-04696	Guaranteed Reagent
K2S2O8	Wako	169-11891	Nitrogen and Phosphorus analysis grade
KCl	Wako	163-03545	Guaranteed Reagent
KNO3	Wako	160-04035	Guaranteed Reagent
NaOH	Wako	191-08625	Nitrogen compounds analysis grade
NH4Cl	Wako	017-02995	Guaranteed Reagent
Plastic centrifuge tube	ASONE	1-3500-22	50 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 13985	Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens
PTFE sealing tape	Sigma-Aldrich	Z221880	25 mm in width
Reciprocating shaker	TAITEC	0000207-000	NR-10
Screw-cap test tube	IWAKI	84-0252	11 mL
PTFE-lined cap for test tube	IWAKI	84-0262
Tryptic Soy Broth	Difco Laboratories	211825