Plasmid di DNA ad alto throughput e trasfezione utilizzando la tecnologia di nanoedispensing acustico

Summary

Questo protocollo descrive la trasflessazione di plasmide ad alto rendimento delle cellule dei mammiferi in una piastra di 384 pozzetto che utilizza la tecnologia di espulsione acustica delle goccioline. L’erogazione e il multiplexing del DNA, che richiedono molto tempo e richiedono errori, ma anche il reagente di trasfezione, sono basati su software ed eseguiti da un dispositivo nanodispenser. Le cellule vengono poi semiate in questi pozzi precompilati.

Abstract

La trasfezione cellulare, indispensabile per molti studi biologici, richiede il controllo di molti parametri per un risultato accurato e di successo. Il più delle volte eseguita a bassa velocità effettiva, è inoltre dispendiosa in termini di tempo e soggetto a errori, ancora di più quando si multiplano diversi plasmidi. Abbiamo sviluppato un metodo semplice, veloce e preciso per eseguire la trasfezione cellulare in un layout a piastre a 384 pozze utilizzando la tecnologia di espulsione acustica delle goccioline (ADE). Il dispositivo nanodispenser utilizzato in questo studio si basa su questa tecnologia e consente la consegna precisa di nanovolume ad alta velocità da una piastra di pozzo di origine a una di destinazione. Può erogare e multispensare il DNA e il reagente di trasfezione secondo un foglio di calcolo pre-progettato. Qui presentiamo un protocollo ottimale per eseguire la trasfezione ad alta velocità basata su ADE che consente di raggiungere un’efficienza fino al 90% e una cotransfezione quasi al 100% negli esperimenti di cotransfezione. Estendiamo il lavoro iniziale proponendo una macro basata su fogli di calcolo user-friendly, in grado di gestire fino a quattro plasmidi/pozzi da una libreria contenente fino a 1.536 diversi plasmidi e un’applicazione di guida al pipettaggio basata su tablet. La macro progetta i modelli necessari delle lastre di origine e genera i file pronti all’uso per il nanodispenser e l’applicazione basata su tablet. Il protocollo di trasfezione a quattro fasi coinvolge i) un dispense diluente con un gestore di liquidi classico, ii) distribuzione del plasmide e multiplexing, iii) un reagente di trasfezione erosi dal nanodispense, e iv) placcatura cellulare sui pozzi precompilati. Il controllo basato su software descritto di ADE plasmide multiplexing e trasfezione consente anche ai non specialisti del settore di eseguire una trasfezione cellulare affidabile in modo rapido e sicuro. Questo metodo consente di ottenere rapidamente l’identificazione delle impostazioni ottimali per un determinato tipo di cellula e può essere trasposto in approcci manuali e su scala più elevata. Il protocollo facilita le applicazioni, come la proteina UMANA ORFeome (insieme di frame di lettura aperti [ORF] in un genoma) espressione o la convalida della funzione genica basata su CRISPR-Cas9, in strategie di screening non di pool.

Introduction

Il metodo qui presentato descrive in dettaglio come eseguire il plasmide del DNA e la trasfezione nelle cellule dei mammiferi ad alta produttività utilizzando un nanodispenser liquido a base acustica in una piastra di 384 pozze, anche per i non specialisti del settore. Questo metodo^{pubblicato di} recente 1 permette di eseguire fino a 384 condizioni indipendenti di multiplexing e trasfezione del DNA plasmide in un esperimento, in meno di 1 h. Gli esperimenti di cotrafezione o singolo hanno avuto successo, raggiungendo un quasi 100% cotrafezione all’interno della popolazione di cellule trasfette. Questo protocollo semplifica la trasfezione perché la maggior parte dei passaggi noiosi, dispendiosi in termini di tempo e soggetti a errori sono ora guidati dal software (vedere Figura 1 per una panoramica generale). Ulteriori sforzi sono stati fatti per sviluppare strumenti dedicati per migliorare la facilità d’uso evitando gli errori umani durante il processo complessivo e per promuovere la trasfezione di successo anche per i non specialisti nel campo. Il protocollo descritto include un foglio di calcolo macro “user-friendly” che abbiamo sviluppato al fine di gestire 384 condizioni di trasfezione indipendenti con possibilità di multiplexing fino a quattro plasmidi in ogni pozzo. La macro genera automaticamente modelli delle lastre di origine per caricare il volume di plasmid di DNA previsto dall’avvio di soluzioni di stock e i file necessari per guidare il software nanodispenser sul progetto sperimentale che è stato inserito. Poiché l’erogazione manuale del DNA in una piastra sorgente 384-well è noiosa e soggetta a errori, abbiamo anche sviluppato un’applicazione dedicata basata su tablet per guidare l’utente durante l’erogazione della soluzione di DNA secondo il modello.

Figura 1: flusso di lavoro sperimentale. Rappresentazione schematica del protocollo di trasfezione inversa automatizzato ottimale ad alta velocità effettiva (dalla progettazione sperimentale al test biologico personalizzato). I passaggi manuali sono indicati dal simbolo della mano e il tempo approssimativo per ogni passo è scritto in una casella rossa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Molti esperimenti basati sulle cellule iniziano con la trasfezione del DNA plasmida, e anche se molti reagenti dedicati sono stati e sono ancora in fase di sviluppo per migliorare l’efficienza della trasfezione e/o facilitare la procedura, molto resta da fare^{2,3 , 4}. La trasfezione cellulare plasmida di DNA prevede diversi passaggi per raggiungere un’elevata efficienza, come un assorbimento complesso iniziale, fuga endosomica e trasporto citoplasmatico al nucleo^5,6. Oltre alla precipitazione di calcio o tecniche fisiche come elettroporazione o microiniezione utilizzando dispositivi dedicati⁷, i moderni metodi chimici si sono concentrati sul miglioramento della somministrazione di cellule del DNA, abbassando la citossicità cellulare^{8, 9}. L’uso di lipidi o polimeri cationici che formano complessi simili a liposomi e, più recentemente, sistemi chimici polimerici non liposomici ha reso la trasfezione più facile e più efficiente¹⁰. Nonostante questi sviluppi, la trasfezione cellulare richiede ancora competenze specifiche per essere eseguita con precisione poiché la maggior parte di questi protocolli di trasfezione fisica o chimica richiedono agli scienziati di preparare manualmente ogni condizione di reazione alla trasfezione del DNA, compromissione della velocità effettiva. Per aggirare questo problema, sono stati sviluppati protocolli di trasfezione inversa utilizzando reagenti di trasfezione chimica^11,12,13, consentendo all’utente di testare o combinare diversi plasmidi in modo più veloce. In questi protocolli, si formano complessi di acido nucleico con reagenti di trasfezione prima di seminare le cellule sui complessi. Tuttavia, questi protocolli inversi sono ancora limitati dalla gestione manuale delle soluzioni del DNA e dalla combinazione di ciascuna delle condizioni indipendenti. Anche se è possibile eseguirli in un formato di piastra 96-well, la preparazione del DNA e dispensa sarà noioso, e probabilmente ci saranno errori. Quando sono necessarie e multiplexed con l’altro diverse quantità di diversi plasmidi di DNA, la trasfezione cellulare diventa ancora più difficile da raggiungere e gli errori umani diventano abbastanza inevitabili. Scalare fino al formato a 384 pozze in un approccio di trasfezione inverso, nonostante poche condizioni di trasfezione del DNA multiplexed, diventa una sfida impossibile a causa dei seguenti motivi. i) I volumi di DNA, reagente di trasfezione o miscela di reazione da gestire sono inferiori a 1 -L per ogni pozzo. ii) Il multiplexing di plasmidi per 384 condizioni indipendenti diventa estremamente complicato. La consegna in ciascuno dei 384 pozzi è anche iii) molto dispendioso in termini di tempo e iv) soggetto a errori. Infatti, erogare la soluzione giusta nei pozzi attesi è difficile da gestire perché i bassi volumi già erogati non consentono il monitoraggio visivo tra i pozzi vuoti e quelli già riempiti. v) Infine, c’è un alto rischio di essiccazione della miscela per evaporazione prima che le cellule vengano aggiunte a causa del tempo necessario per eseguire le fasi di erogazione necessarie. In sintesi, il fattore limitante per impostare analisi di trasfezione del DNA ad alto consumo sembra essere la miniaturizzazione dell’analisi, che implica multiplexing e gestione a basso volume che non possono più essere gestiti manualmente, ma sono anche difficilmente raggiungibili in un affidabile dai classici gestori di liquidi peristatici.

Come prova di difficoltà per automatizzare tali saggi e ottenere un alto rendimento, solo pochi tentativi di automatizzare la trasfezione sono stati pubblicati finora: un formato di piastra di 96 pozzetti che utilizza un dispositivo di movimentazione dei liquidi commerciali e precipitazioni di fosfato di calcio¹⁴ e, più recentemente, un reagente lipoplex e un chip microfluidico che consentono 280 trasfettazioni indipendenti¹⁵ ma richiedono competenze specializzate in questo campo. Un altro metodo, l’acoustoforesi, che consente la levitazione liquida e porta alla manipolazione e miscelazione dei fluidi, è stato utilizzato per eseguire la trasfezione del DNA nei formati da 24 a 96 pozzi¹⁶. Anche se fattibile, questo approccio soffre di una produttività estremamente bassa in quanto la miscela di cellule con miscela di trasfezione del DNA richiede un’incubazione di 60 s per ogni singolo punto prima della semina. Ciò implica una durata di almeno 96 min per una piastra completa di 96 pozze. Inoltre, questo protocollo è ben lungi dall’essere suscettibile al pubblico generale dei biologi in quanto questo lavoro è stato fatto con un dispositivo progettato e fabbricato in-house che attualmente non è disponibile sul mercato. Al contrario, negli ultimi anni, è emersa una tecnologia di erogazione basata sull’acustica basata su software di facile utilizzo con dispositivi di dispenser nanovolume. Utilizzando energia acustica focalizzata, questi dispositivi consentono l’espulsione strettamente controllata di piccoli volumi di liquidi da 2,5 nL a 500 nL da una piastra di origine a una destinazione¹⁷. Questa tecnologia, chiamata espulsione acustica delle goccioline (ADE), presenta numerosi vantaggi: è completamente automatizzata, senza contatto, senza punta, precisa e altamente riproducibile, e ha un alto throughput¹⁸. In primo luogo dedicato alla fornitura di soluzioni di zolfo dimetilico (DMSO), le impostazioni sono state migliorate per erogare tamponi acquosi¹⁹. I nanodispenser acustici, quindi, sembrano adatti per i protocolli di trasfezione inversa delle cellule e potrebbero aggirare la maggior parte delle limitazioni manuali di cui sopra. Poiché in precedenza non sono stati descritti tentativi di trasfezione plasmida utilizzando questa tecnologia, abbiamo recentemente valutato l’idoneità di un sistema di erogazione basato su acustica per eseguire la trasfezione inversa delle celle.

Approfittando della velocità effettiva dei nanodispenser e della facilità d’uso, abbiamo ottimizzato un protocollo di trasfezione inversa per le cellule HeLa verificando diversi parametri che possono influenzare la trafezione del DNA su una piastra singola di 384 pozzetto, vale a dire la quantità totale di DNA e concentrazione iniziale del DNA sorgente, volume diluente, reagente di trasfezione e numero di cellule di diffusione. Il protocollo sviluppato aggira i limiti manuali sopra descritti della trasfezione cellulare e presenta diversi vantaggi rispetto ad altri tentativi di trasfezione automatizzati. In primo luogo, è miniaturizzato, consentendo così un reagente di trasfezione conveniente salvando i preparati del plasmide del DNA e il reagente di trasfezione. In secondo luogo, è molto più ad alto rendimento e riproducibile rispetto al protocollo manuale (anche per i principianti), in quanto la trasfezione di un’intera piastra di 384 pozzetto può essere ottenuta in meno di 1 h. Infine, è basato sul software, consentendo il controllo della quantità di DNA erogato e il multiplexing di diversi plasmidi. Infatti, grazie al software nanodispenser (Tabella dei materiali), l’utente può elaborare un piano di studio per controllare i volumi da erogare da una piastra di origine definita a una di destinazione.

Il protocollo qui presentato è destinato principalmente a coloro che hanno accesso a un nanodispenser e vorrebbero impostare esperimenti di trasfezione ad alta produttività, ma anche per coloro che vogliono ottimizzare rapidamente i loro parametri di trasfezione per un determinato tipo di cellula l’applicazione di questo protocollo per eseguire il cross-test di diversi parametri a velocità effettiva elevata. In effetti, abbiamo dimostrato che i parametri ottimizzati identificati con questo protocollo su nanoscala possono essere trasposti in esperimenti di trasfezione su larga scala e manuali. Infine, poiché il reagente di trasfezione utilizzato nel presente protocollo consente la trasfezione del DNA o del siRNA secondo il produttore, il protocollo è anche di interesse per coloro che mirano a eseguire approcci di array per la sovraespressione genica o il knockdown. Le piastre di destinazione precompilate con DNA possono essere conservate fino a 7 giorni prima dell’uso in un saggio di trasfezione senza perdita di efficacia, che è un altro vantaggio del seguente protocollo per questo tipo di applicazione.

Protocol

1. Preparazione anticipata Preparazione dei programmi di gestione dei liquidi peristalticiNOTA: Per le fasi di diluente e di erogazione cellulare del protocollo, è necessario preparare un programma dedicato, tenendo conto dell’altezza della testa di erogazione alla piastra utilizzata e dell’intento di passo. Per il passo di diluente 1 L, montare una cassetta da 1 ll e preparare un programma con le impostazioni come descritto nei passaggi 1.1.1.1 e 1.1.1.2. Regolare il param…

Representative Results

Al fine di determinare se la tecnologia ADE potrebbe essere utilizzata per un protocollo di trasfezione inversa automatizzato, abbiamo monitorato l’efficienza della trasfezione cellulare mediante microscopia a fluorescenza, utilizzando un plasmide fluorescente rosso fluorescente. In primo luogo puntando a determinare i migliori parametri di trasfezione, diversi volumi diluenti e quantità totali di DNA sono stati testati in modo incrociato. Il volume diluente è stato utilizzato per conse…

Discussion

L’istituzione e l’ottimizzazione di un accurato metodo di trasflessazione ad alto throughput per una determinata linea cellulare richiedono agli scienziati di seguire alcuni parametri chiave descritti in questa sezione. Incoraggiamo vivamente a partire dai valori raccomandati in tutto il protocollo poiché queste impostazioni ottimizzate per le cellule HeLa si sono dimostrate efficienti anche per le cellule HEK. Tuttavia, poiché i parametri migliori possono dipendere dalle linee cellulari e dai reagenti di trasfezione, …

Materials

384LDV Microplate	Labcyte	LP-0200
384-well Microplate μClear Black	Greiner	781906
Ampicilin	Sigma	A9393-5G	Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector
Android Tablet	Samsung	Galaxy Note 8	used to guide the user while the source plate manual dispense
Aniospray Surf 29	Anios	2421073	disinfectant to clean the MicroFlo head
Columbus software	Perkin Elmer		image analysis software
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	10566032	cell culture medium
Echo Cherry Pick 1.5.3 software	Labcyte		Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software
Echo550	Labcyte		ADE-based dispenser
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000044	to add in cell culture medium
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128-4L	to fix cell
HeLa cells	ATCC	HeLa (ATCC® CCL-2™)
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570	10 mg/mL Solution in Water
INCell Analyzer 6000	GE Healthcare	29043323	automated laser-based confocal imaging platform
LB medium	Thermoischer Scientific LB Broth Base (Lennox L Broth Base)®, powder	12780052	culture medium for bacteria growth
Lysis Buffer (A2)	Macherey-Nagel	740912.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
MicroFlo 10µL cassette	Biotek Instruments Inc	7170013	to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo 1μL cassette	Biotek Instruments Inc	7170012	to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo Dispenser	Biotek Instruments Inc	7171000	peristaltic pump-based liquid handler device
Microvolume spectrophotometer	Denovix	DS-11 Spectrophotometer	Measure the DNA concentration of samples
mVenus plasmid	mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid		Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus
Neutralization Buffer (A3)	Macherey-Nagel	740913.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
NucleoSpin Plasmid kit	Macherey-Nagel	740588.50	used to prepare plasmid from bacterial culture
Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium	Thermo Fisher Scientific	31985070
optional Wash bufferWash Buffer (A4)	Macherey-Nagel	740914.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
orbital shaker	incubated large capacity shaker	444-7084	Used to grow bacteria under gentle agitation and 37°C
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	10,000 U/mL
Phosphate-Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	10010001
Plasmid mini-columns	Macherey-Nagel	740499.250	Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture
Resuspension Buffer (A1)	Macherey-Nagel	740911.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
RNAse A	Macherey-Nagel	740505	Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
tdTomato-N1 plasmid	Addgene	Plasmid #54642	Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato
TransIT-X2 Dynamic Delivery System	Mirus Bio	MIR 6000
Wash Buffer (AW)	Macherey-Nagel	740916.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
3D printer	Creality	CR10S	used to print the plate adapter
Blender Software	https://www.blender.org/ Free software under GNU General Public License (GPL).	version 2.79b	used to design the plate adapter