Questo protocollo descrive la trasflessazione di plasmide ad alto rendimento delle cellule dei mammiferi in una piastra di 384 pozzetto che utilizza la tecnologia di espulsione acustica delle goccioline. L'erogazione e il multiplexing del DNA, che richiedono molto tempo e richiedono errori, ma anche il reagente di trasfezione, sono basati su software ed eseguiti da un dispositivo nanodispenser. Le cellule vengono poi semiate in questi pozzi precompilati.
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Articolo metodologico
Plasmid di DNA ad alto throughput e trasfezione utilizzando la tecnologia di nanoedispensing acustico
In questo articolo
Sommario
Abstract
La trasfezione cellulare, indispensabile per molti studi biologici, richiede il controllo di molti parametri per un risultato accurato e di successo. Il più delle volte eseguita a bassa velocità effettiva, è inoltre dispendiosa in termini di tempo e soggetto a errori, ancora di più quando si multiplano diversi plasmidi. Abbiamo sviluppato un metodo semplice, veloce e preciso per eseguire la trasfezione cellulare in un layout a piastre a 384 pozze utilizzando la tecnologia di espulsione acustica delle goccioline (ADE). Il dispositivo nanodispenser utilizzato in questo studio si basa su questa tecnologia e consente la consegna precisa di nanovolume ad alta velocità da una piastra di pozzo di origine a una di destinazione. Può erogare e multispensare il DNA e il reagente di trasfezione secondo un foglio di calcolo pre-progettato. Qui presentiamo un protocollo ottimale per eseguire la trasfezione ad alta velocità basata su ADE che consente di raggiungere un'efficienza fino al 90% e una cotransfezione quasi al 100% negli esperimenti di cotransfezione. Estendiamo il lavoro iniziale proponendo una macro basata su fogli di calcolo user-friendly, in grado di gestire fino a quattro plasmidi/pozzi da una libreria contenente fino a 1.536 diversi plasmidi e un'applicazione di guida al pipettaggio basata su tablet. La macro progetta i modelli necessari delle lastre di origine e genera i file pronti all'uso per il nanodispenser e l'applicazione basata su tablet. Il protocollo di trasfezione a quattro fasi coinvolge i) un dispense diluente con un gestore di liquidi classico, ii) distribuzione del plasmide e multiplexing, iii) un reagente di trasfezione erosi dal nanodispense, e iv) placcatura cellulare sui pozzi precompilati. Il controllo basato su software descritto di ADE plasmide multiplexing e trasfezione consente anche ai non specialisti del settore di eseguire una trasfezione cellulare affidabile in modo rapido e sicuro. Questo metodo consente di ottenere rapidamente l'identificazione delle impostazioni ottimali per un determinato tipo di cellula e può essere trasposto in approcci manuali e su scala più elevata. Il protocollo facilita le applicazioni, come la proteina UMANA ORFeome (insieme di frame di lettura aperti [ORF] in un genoma) espressione o la convalida della funzione genica basata su CRISPR-Cas9, in strategie di screening non di pool.
Introduzione
Il metodo qui presentato descrive in dettaglio come eseguire il plasmide del DNA e la trasfezione nelle cellule dei mammiferi ad alta produttività utilizzando un nanodispenser liquido a base acustica in una piastra di 384 pozze, anche per i non specialisti del settore. Questo metodopubblicato di recente 1 permette di eseguire fino a 384 condizioni indipendenti di multiplexing e trasfezione del DNA plasmide in un esperimento, in meno di 1 h. Gli esperimenti di cotrafezione o singolo hanno avuto successo, raggiungendo un quasi 100% cotrafezione all'interno della popolazione di cellule trasfette. Questo protocollo semplifica la trasfezione perché ....
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Protocollo
1. Preparazione anticipata
- Preparazione dei programmi di gestione dei liquidi peristaltici
NOTA: Per le fasi di diluente e di erogazione cellulare del protocollo, è necessario preparare un programma dedicato, tenendo conto dell'altezza della testa di erogazione alla piastra utilizzata e dell'intento di passo.- Per il passo di diluente 1 L, montare una cassetta da 1 ll e preparare un programma con le impostazioni come descritto nei passaggi 1.1.1.1 e 1.1.1.2.
- Regolare il parametro della portata su Alta per ottenere la migliore velocità effettiva, in quanto non sono previsti danni materiali biologici in quest....
- Per il passo di diluente 1 L, montare una cassetta da 1 ll e preparare un programma con le impostazioni come descritto nei passaggi 1.1.1.1 e 1.1.1.2.
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Risultati
Al fine di determinare se la tecnologia ADE potrebbe essere utilizzata per un protocollo di trasfezione inversa automatizzato, abbiamo monitorato l'efficienza della trasfezione cellulare mediante microscopia a fluorescenza, utilizzando un plasmide fluorescente rosso fluorescente. In primo luogo puntando a determinare i migliori parametri di trasfezione, diversi volumi diluenti e quantità totali di DNA sono stati testati in modo incrociato. Il volume diluente è stato utilizzato per consent.......
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Discussione
L'istituzione e l'ottimizzazione di un accurato metodo di trasflessazione ad alto throughput per una determinata linea cellulare richiedono agli scienziati di seguire alcuni parametri chiave descritti in questa sezione. Incoraggiamo vivamente a partire dai valori raccomandati in tutto il protocollo poiché queste impostazioni ottimizzate per le cellule HeLa si sono dimostrate efficienti anche per le cellule HEK. Tuttavia, poiché i parametri migliori possono dipendere dalle linee cellulari e dai reagenti di trasfezione, le.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori hanno rivelato una ricevuta del seguente sostegno finanziario per la ricerca, la paternità e/o la pubblicazione di questo articolo: Inserm, Lille University, Lille Pasteur Institute, Conseil Régional du Nord, e PRIM-HCV1 e 2 (P Interdisciplinaire sur le Médicament), Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-EQPX-04-01), la Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) e la Comunità Europea (ERC-STG INTRACELL nTB 260901). Gli autori desiderano ringraziare il Dr. S. Moureu, il Dr. B. Villemagne, il Dr. R. Ferru-Clément e il Dr. H. Groult per la loro revisione critica e le correzioni del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 384LDV Micropiastra | Labcyte | LP-0200 | |
| Micropiastra a 384 pozzetti μ | Chiaro Nero Greiner | 781906 | |
| Ampicilin | Sigma | A9393-5G | Antibiotico di selezione per batteri trasformati con ampicilina che esprime vettore |
| Android Tablet | Samsung | Galaxy Note 8 | utilizzato per guidare l'utente mentre la piastra di origine eroga manualmente |
| Aniospray Surf 29 | Anios | 2421073 | disinfettante per pulire la testa MicroFlo |
| Columbus software | Perkin Elmer | software di analisi delle immagini | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), glicemia alta, integratore GlutaMAX, piruvato | Thermo Fisher Scientific | 10566032 | terreno di coltura cellulare |
| Echo Cherry Pick 1.5.3 software | Labcyte | Software che abilita le erogazioni basate su ADE da parte del dispositivo Echo550 da un file *.csv; software nanodispenser | |
| Echo550 | Labcyte | Dispenser a base di ADE | |
| Siero Fetale Bovino | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | di aggiungere nel terreno di coltura cellulare |
| una soluzione di formalina, tamponata neutra, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | per fissare |
| le cellule HeLa | ATCC | HeLa (ATCC® CCL-2&commercio;) | |
| Hoechst 33342, Tricloridrato, Triidrato | Thermo Fisher Scientific | H3570 | 10 mg/mL Soluzione in acqua |
| INCell Analyzer 6000 | GE Healthcare | 29043323 | Piattaforma di imaging confocale automatizzata basata su laser |
| LB medium | Thermoischer Scientific LB Broth Base (Lennox L Broth Base)®, polvere | 12780052 | terreno di coltura per la crescita |
| dei batteriTampone di lisi (A2) | Tampone Macherey-Nagel | 740912.1 | dal kit NucleoSpin Plasmid utilizzato per preparare plasmidi da coltura batterica |
| MicroFlo 10µ Cassetta L | Biotek Instruments Inc | 7170013 | da utilizzare con il Microflo Dispenser |
| MicroFlo 1μ Cassetta L | Biotek Instruments Inc | 7170012 | da utilizzare con il dispenser Microflo Dispenser |
| MicroFlo | Biotek Instruments Inc | 7171000 | dispositivo di gestione dei liquidi basato su pompa peristaltica |
| Spettrofotometro per microvolumi Spettrofotometro | Denovix | DS-11 | Misura la concentrazione di DNA dei campioni |
| di plasmide | mVenusIl cDNA di mVenus è stato clonato mediante digestione e legatura con restrizione enzimatica nei siti Age1/BsrG1 del plasmide tdTomato-N1 | Tipo di vettore: Espressione dei mammiferi, proteina di fusione: tampone di neutralizzazione di mVenus | |
| Tampone Macherey-Nagel | 740913.1 | dal kit NucleoSpin Plasmid utilizzato per preparare plasmidi da colture batteriche | |
| Kit NucleoSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 740588.50 | utilizzato per preparare plasmidi da colture batteriche |
| Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| tampone di lavaggio opzionaleWash Buffer (A4) | Macherey-Nagel | 740914.1 | Tampone dal kit NucleoSpin Plasmid utilizzato per preparare il plasmide dall'agitatore |
| orbitale di coltura batterica. | agitatore incubato di grande capacità | 444-7084 | Utilizzato per far crescere batteri sotto agitazione delicata e 37° C |
| Penicillina-Streptomicina | Thermo Fisher Scientific 15140122 | 10.000 U/mL | |
| salina tamponata con fosfato | Thermo Fisher Scientific | 10010001 | |
| Mini-colonne di plasmidi | Macherey-Nagel | 740499.250 | Mini-colonna con membrana di silice per preparare il plasmide da coltura batterica |
| Tampone di risospensione (A1) | Macherey-Nagel | 740911.1 | Tampone dal kit di plasmidi NucleoSpin utilizzato per preparare il plasmide da coltura batterica |
| RNAsi A Enzima | Macherey-Nagel | 740505 | dal kit di plasmidi NucleoSpin utilizzato per preparare il plasmide da coltura batterica |
| tdPlasmide di pomodoro-N1 | Addgene | Plasmide #54642 | Tipo di vettore: Espressione di mammiferi, proteina di fusione: tdPomodoro |
| TransIT-X2 Dynamic Delivery System | Mirus Bio | MIR 6000 | |
| Wash Buffer (AW) | Macherey-Nagel | 740916.1 | Buffer dal kit NucleoSpin Plasmid utilizzato per preparare il plasmide dalla stampante 3D da coltura batterica |
| Creality | CR10S | utilizzato per stampare l'adattatore per piastre | |
| https://www.blender.org/ Software libero sotto licenza GNU General Public License (GPL). | La versione 2.79b | utilizzata per progettare l'adattatore per piastre |
Riferimenti
- Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. , 2472555218803064(2018).
- Mirus Bio. Optimising Transfection Performance. , (2019).
- Thermo Fisher Scientific.
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Ristampe e permessi
