Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מודל עכברוש הרומן והטרנסלבית של זעזוע מוח שילוב כוח וסיבוב עם Vivo מוחין מיקרודיאליזה

Published: July 12, 2019 doi: 10.3791/59585
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1
1Research Center, Hôpital du Sacré-Cœur de Montréal, 2Research Center, Douglas Institute

Summary

שינוי מוליך עצבי הוא מנגנון של תפקוד עצבי המתרחשת לאחר זעזוע מוח תורם להשלכות לפעמים קטסטרופלי לטווח ארוך. מודל עכברוש זה משלב מיקרודיאליזה, המאפשר לכמת את הvivo הנוירוטרנסמיטור, עם טכניקת טיפה משקל הפעלת האצה מהירה והאטה של הראש והגוף, גורם חשוב של טראומה הגולגולת האנושית.

Abstract

קוגניטיבי מתמשך סימפטומים מוטוריים הם השלכות ידועות של זעזוע מוח/פציעה מתונה טראומטית (mTBIs) כי ניתן לייחס בחלקו שונה נוירותמסורת. אכן, לימודי מיקרודיאליזה מוחית במכרסמים הפגינו מקבל מוגזם גלוטמט לשחרר בהיפוקמפוס בתוך הראשון 10 דקות לאחר טראומה. מיקרודיאליזה מציעה את היתרון הברור של vivo מוליך עצבי מתמשך בזמן שאין צורך להקריב את החיה. בנוסף לטכניקה הנ ל, יש צורך במודל לפגיעה בראש סגור, הגורם להאצה ולהאטה מהירה של הראש והפלג הגוף העליון, משום שפקטור כזה אינו זמין בדגמים רבים אחרים של בעלי חיים. מודל משקל המדינה של ויין מחקה את הרכיב החיוני הזה של טראומה הגולגולת האנושית, המאפשר אינדוקציה של השפעה על ראשו של מכרסם מרסן עם משקל נופל. מודל עכברוש הרומן והתרגום שלנו משלב מיקרודיאליזה מוחית עם מודל שחרור משקל המדינה של ויין ללמוד, בקלות מורדם ומלא מעצורים חולדות מבוגרים, שינויים חריפה ברמות הנוירוטרנסמיטור החילוץ בעקבות זעזוע מוח. בפרוטוקול זה, הגשוש המיקרודיאליזה הוכנס לתוך ההיפוקמפוס כאזור מעניין, והוא הושאר במוח בהתנגשות. יש צפיפות גבוהה של מסופים וקולטנים בהיפוקמפוס, מה שהופך אותו לאזור רלוונטי לתעד שינוי נוירושידור לאחר זעזוע מוח. כאשר הוחל על חולדות מבוגרים הג דאולי, מודל משולב שלנו מגדילה בריכוזים של מסחטות גלוטמט ריכוזי בתוך 10 דקות הראשון, עקבי עם הסימפטומים הקודמים שדווחו לאחר זעזוע מוח. מודל זה משולב ירידה במשקל מספק כלי אמין עבור חוקרים ללמוד תגובות טיפוליות מוקדם כדי זעזוע מוח בנוסף לפגיעה מוחית חוזרת, מאז פרוטוקול זה גורם טראומה מתון ראש סגור.

Introduction

מטרת שיטה זו היא לספק לחוקרים כלי אמין אשר מתרבה בנאמנות את הביומכניקה של טראומה הגולגולת האנושית תוך מתן אפיון האורך של ההשפעות המולקולריות של זעזוע מוח/מתון טראומטי פציעה (mTBIs). שיטה זו משלבת מיקרודיאליזה מוחית עם מודל שחרור משקל המדינה של ויין למסמך, מורדם בקלות חולדות למבוגרים ללא רסן, שינויים חריפה ברמות הנוירוטרנסמיטר מסחטות בעקבות זעזוע מוח. עם זו שיטה מינימלית פולשנית, נוירוטרנסמיטורים כגון גלוטמט, נגבה, taurine, גליצין ו סרין יכול להיות במהירות וברציפות לאחר טראומה, ב vivo, בעוד לא להקריב את החיה.

זעזוע/מצחבי הוא שיבוש פתופסולוגי המשפיע על תפקוד המוח הנגרם על ידי מנגנון כוח חיצוני. זעזוע/mTBI היא הצורה השכיחה ביותר של פגיעה מוחית טראומטית, חשבונאות עבור 70-90% מהמקרים1. רוב ההפרעות הפונקציונליות חריפה בעקבות זעזוע ניתן לייחס לפגיעה במוח העיקרי ומשני2,3: (1) את הפגיעה במוח העיקרי הוא המושרה על ידי האצה מהירה האטה של הראש והגוף אשר נזקים רקמות המוח על ידי דחיסה ואחריו מתיחה והטיה של אקסונים במהלך ההתנגדות4,5,6 ו (2) פגיעה במוח המשני היא תגובה תאית עקיפה לטראומה. זה מתרחש שעות וימים לאחר פגיעת המוח העיקרי וממלא תפקיד חשוב בליקוי מנוע קוגניטיבי הבחין לאורך זמן. רבים מן הסימפטומים ניתן לייחס נוירותמסורת שונה כגון בעבר הפגינו מוגזמת גלוטמט מוגזם לשחרר את הראשון 10 דקות פציעה בעקבות7,8,9. בהינתן הצפיפות הגבוהה של מסופים וקולטנים, ההיפוקמפוס הוא מבנה המוח פגיע במיוחד לתגובה זו מרגש לאחר הפציעה. להיות מעורב בכבדות בתפקוד קוגניטיבי10,11, מחקרים מכרסמים דיווחו כי נזק היפוקמאל הקשורים זעזוע מוח יכול להוביל ליקויים במיזוג פחד ולמידה מרחבית זיכרון12 , 13. המטרה העיקרית של מתודולוגיה זו היתה לעבוד מודל חולדה של זעזוע מוח/מצחבי, באמצעות מדינת ויין סגור משקל ראש הליך שחרור בנאמנות כדי לשכפל את המנגנונים של פגיעת המוח העיקרי, ולשלב מוחין מיקרודיאליזה ללמוד ב vivo, הנוירוטרנסמיטר מסחטות חריפה שינויים בשל פגיעה מוחית משנית בעקבות זעזוע מוח. ריכוזים של גלוטמט מסחטות ו-נגבה נמדדו בהיפוקמפוס לפעול כתוצאות מייצגות של השיטה שלנו.

מחקרים קודמים מכרסם יש משולבים מיקרודיאליזה ומודלים אחרים של פציעה, כגון ירידה במשקל הגולגולת משקל ההשפעה הקורטיקלית מבוקרת, כדי להדגים את השינויים אקוטי ברמות הנוירוטרנסמיטור לחילוץ בעקבות פציעה של חומרת שונות . מעלות14,15,16,17 עם זאת, בנוסף לדרגות גבוהות של השתנות, הערך הטרנסלtional של מודלים כמו ירידה במשקל הגולגולת הפתוחה השפעה קליפת המוח מבוקרת הוא הושפע מהעדר הטבועה של תוקף אקולוגי בשל 2 גורמים: (1) מודלים אלה לגרום לפציעות הרבה חמורים יותר מזעזוע המוח הקשור לספורט, שסבלו בבני אדם, מעורבים בטעינה ישירה של מוחי (2) מודלים אלה מחייבים ניתוח גולגולת או פתיחת גולגולת, ראשו של המכרסמים מרוסן לחלוטין במסגרת סטריאוטקאית, ומסכל את המהירות ה האצה והאטה של הראש והגוף, ובכך לשחזר את הביומכניקה של זעזוע מוח.

Microdialysis היא שיטה מינימלית פולשנית אשר מציעה את היתרון הברור של דגימות נוירוטרנסמיטורים כגון גלוטמט, נגבה, taurine, גליצין ו סרין, ב vivo וברציפות לאחר טראומה, בעוד לא להקריב את החיה. בנוסף ליתרונות המוצעים על ידי מיקרודיאליזה, האוניברסיטה הממלכתית של וויין פיתחה מודל סגור גולגולת משקל (בניגוד לגולגולת פתוח מדגמים אחרים), אשר מאפשר את האינדוקציה של mTBI על מכרסם קל ומלא מעצורים, ובכך מאפשר האצה והאטה מהירים של הראש והפלג הגוף העליון18. כפי שהוזכר קודם לכן, האצת והאטה של הראש והגוף הוא תכונה ביומכנית ליבה של הקשורות לספורט הקשורים הזעזוע לראות בבני אדם כי הדגמים הקודמים מכרסמים mTBI לא היתה כתובת. ההליך ירידה במשקל יכול להיעשות מהר מאוד ואינו דורש שום ניתוח קודם או חתך הקרקפת. בעקבות אינדוקציה של זעזוע מוח, מכרסמים לשחזר את רפלקס הצתה כמעט באופן ספונטני לא חווים שיתוק, התקפים או מצוקה נשימתית לאחר השפעה אחת. דימום תוך-גולגולתי ושברים בגולגולת הם נדירים, ורק חסרים קטנים בתיאום מוטורי דווחו במכרסמים. מודל זה עכברוש הוא קל לשימוש, זולה ומקלה על כימות של נוירוטרנסמיטורים שפורסמו בשלב אקוטי לאחר זעזוע מוח מבלי להסיר את הגשוש מיקרודיאליזה במהלך הפגיעה.

המודל העכברוש שלנו המשלב מיקרודיאליזה וזעזוע מוח מתאים לחוקרים המבקשים לאפיין את longitudinally ההשפעות המולקולריות של זעזוע מוח וניתן להשתמש בהן במגוון רחב של מחקרים תרפויטיים. אכן, למרות מספר שנים של מחקר וצורך מכריע, אין תרופה כדי למנוע את ההשפעות ארוכת טווח של זעזוע מוח עבר את שלב הניסוי הקליני19. אחת הסיבות הפוטנציאליות לכשלים אלה יכולה להיות השימוש במודלים של בעלי חיים שאינם מתרבים בנאמנות את הכוחות הביומכתיים הטראומטיים של זעזוע מוח כמנוסה על ידי בני אדם. השיטה המוצגת כאן עונה על ההגדרה של זעזוע מוח אנושי המציין כי הפגיעה במוח העיקרי נגרמת על ידי השפעה קהה, כמו גם האצה מהירה והאטה של הראש והפלג הגוף העליון2,3.

יתר על כן, המודל המשולב שלנו מתאים לחוקרים ללמוד את ההשפעות של פגיעה מוחית טראומטית קלה ונשנית (rmTBI) מאז אחד המאפיינים העיקריים שלה המגדיר אותו מלבד מודלים בעלי חיים אחרים של זעזוע מוח הוא שזה מאפשר לגרום . פציעות חוזרות ונשנות לאותו תיק18 בבני אדם, rmtbi קשורה לתסמינים חמורים יותר פוסט טראומטית, זמני התאוששות ארוכים, מנוע מחמירות וליקויים קוגניטיביים שנוטים להתפשט במשך הזמן20,21. דגמי בעלי חיים רלוונטיים אחרים גם אפשרו להבין טוב יותר את הפתופסיולוגיה פוסט טראומטית של rmtbi22,23,24,25,26,27 . פגיעות המוח המוגבר הפגינו מכרסמים לאחר מינימום של 5 mTBI במרווחי זמן 24 h. דלקת נוירובי מגדילה את מספר הניסיון של mTBI וסמנים של ניוון נוירואני מופיעים28. Mtbi חוזרות היה למנוע את המעבר של מיקרוגלייה ממצב proinflammatory למצב רגיל של התאוששות, וכתוצאה מכך פעילות ממושכת ורעילה הפעלה של מנגנונים ניווניות 29. עם המודל שלנו, חולדות יכול להיות חשוף 1 השפעה ליום במשך השבוע 1 עבור סך של 5 חשיפות. בהינתן הפשטות של המודל החי הזה, זה יכול להקל על האפיון של ההשפעות המצטברות של שחרור הנוירוטרנסמיטר חריפה הבחנה הנובעים מיד לאחר mTBI.

מודל זה מאפשר גם בעלי חיים להיות חשופים בקלות 2 השפעות ליום, מה שמאפשר ללמוד אפילו יותר מצבים חמורים כגון כאשר ספורטאי מקבל השפעה טראומטית נוספת בתוך זמן קצר מן המכה הראשונה30. כפי שמתואר במחקר הקודם31, העיתוי של מכה שנייה לראש יכול להשפיע באופן דרמטי על כלי דם ונזק סיבי. ככל שהמכה השניה מתקרבת למכה הראשונה, כך ההשלכות מזיקות יותר. מודל זה מתאים לחקירת כיצד זה מצב מסוים משפיע על שחרור מוליך עצבי החילוץ.

בשיטה זו, ההיפוקמפוס שימש אזור הריבית בשל הרלוונטיות שלה במחקר זעזוע מוח אבל דגימות microdialysis ניתן לאסוף מאזורים אחרים של עניין, כמו גם. עם זאת, כל אזור מוח אחר צריך להיחשב בגלל המרחב שנותר באתר ההשפעה של צינורית המדריך, כולל מלט שיניים המקיפים אותו, יכול לקחת כמות ניכרת של מקום על ראשו של החולדה. בנוסף לכך, הפרמטרים המיקרודיאליזה שהוצגו בשיטה זו כגון המשקל המולקולרי של הממברנה לגזור ואורך פעיל, את מרווחי זמן דגימה ואת קצב הזרימה ניתן לכוונן על פי סוג של מולקולה למדו. אוסף יעיל של ציטוקינים פרו דלקתיים מעורב זעזוע, למשל, ידרוש קרום עם גודל הנקבוביות הרבה יותר גדול.

Protocol

פרוטוקול בעלי החיים עבור פרויקט זה קיבל את האישור מוועדת הטיפול בבעלי חיים של הופטל דו Sacre-Cœur de מונטריאול בהתאם להנחיות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים.

הערה: חלוקה סכמטית של פרוטוקול המחקר מוצגת באיור 1.

1. הכנה לבעלי חיים

  1. הזמנת העכברושים העכברים מתוך הספק בעלי חיים מעבדה סטנדרטית להישלח בין 43 ו 50 ימים של גיל במשקל בין 151 ו 200 g.
  2. האוס כל חולדות בנפרד במחזור של 12:12 h אור: החושך, ב 24-26 ° צ' עם גישה מודעת לימוד למים ומזון.
  3. במהלך 2 השבועות לפני תחילת הפרוטוקול, לטפל בחולדות עבור 5 דקות על בסיס יומי כדי להקל על הרגלה שלהם במגע עם חוקרים. חולדות צריך להיות הזדקן בערך 10 שבועות והמשקל שלהם צריך להיות בין 295 ו 351 g בזמן זעזוע מוח או פגיעה מזויף.

2. מיקרודיאליזה מדריך ניתוח השרשה

  1. בצעו את הניתוח. בתנאים סטריליים לחבוש כפפות סטרילי, מצנפת שיער ומסכה כירורגית לאורך כל התהליך. אוטוקלב ומעקר את כל החומרים ואת כלי הניתוח מראש. לנקות ולחטא את אזור העבודה ואת המנגנון סטריאוטקאית ביסודיות עם פתרון של אתנול (70%).
  2. לגרד את החיות על ידי הזרקת קוקטייל של קטמין (70 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג/ק"ג) intraperitoneally. ישבנים הרדמה עומק ידי בדיקת הרפלקס לצבוט הבוהן.
  3. להסיר פרווה מראשו של בעל החיים באמצעות קוצץ חשמלי. ניקוי ראש מגולח בתמיסה של 2% אלכוהול איזופרופיל ו-2% כלורהקאיצין גלוקונאט (3 פעמים). להחיל משחה עין סיכה במהלך ההרדמה כדי למנוע יובש.
  4. לעטוף את השדה הכירורגי. כך שרק ראש החיה ייחשף הניחו את ראש החולדה במנגנון סטריאוטקאלי, הכניסו את פסי האוזן לתעלות האוזן בזהירות רבה והדקו את מהדק האף. תקן 26 מדריך פלדה פלדת אל-חלד לזרוע המחזיק על המנגנון סטריאוטקאית.
  5. באופן מקומי להזריק קוקטייל הרדמה של bupi, 1.5 mg/ק"ג) ו לידוקאין (1.5 מ"ג/ק"ג) תת-עורי על הראש, 10 דקות לפני החיתוך.
  6. לשמור על הרדמה במהלך כל ההליך על ידי העברת נתרן איזופלוריין (2.5%) ב 0.5 L/min זרימת חמצן עם קונוס האף.
  7. לעשות חתך באמצע קו (3 ס מ) לאורך הקרקפת עם אזמל. להשאיר את הגולגולת ברור על ידי התקנת 4 התפסים סביב החתך.
  8. לגרד את הקרום מהגולגולת בעזרת להב כירורגי עד שהתפרים בברגמה ולמדא יהיו גלויים. לשמור על הלחץ החזק על הגולגולת עם משטח גזה או כותנה משופעת המוליך אם יש דימום.
  9. אשר אם הגולגולת מיושרת כהלכה על המנגנון הסטריאוטקאני על ידי השוואת הקואורדינטות הגוזובנזוניות של התפרים ברסגמה ולמדא. מזהים את הקואורדינטות הanteroposterior, המדיקולאוונדיים והגדוזים של התפר הברגמה כנקודות התייחסות לקואורדינטות של צינורית המדריך.
  10. לקיחת הקואורדינטות ברסגמה כמו הפניות, לחשב את הקואורדינטות של הצינורית מדריך האתר השרשה בהיפוקמפוס.
    הערה: הקואורדינטות הבאות נקבעו על פי אטלס מוח החולדה מ Paxinos ו ווטסון (anteroposterior:-0.60 ס מ; מדיום: ± 0.58 ס מ; דורסובנם2:-0.16 ס"מ, איור 2A)32.
  11. סמן את אתר ההשתלה. המדויק באמצעות סמן
  12. מקדחה חור 0.5 מ"מ דרך הגולגולת באתר היעד של צינורית המדריך. מקדחה 3 חורים אחרים כ 5 מ"מ סביב נקודה זו כדי פתיל 3 ברגים עוגן לתוך הגולגולת כי יהיה לחזק את הצינורית לאחר שיניים אקריליק מלט מוחל.
  13. הכנס את הצינורית לתוך ההיפוקמפוס ותקן אותה עם מלט שיניים. צינורית זו ישמשו להכנסת הגשוש לאזור העניין 7 ימים לאחר מכן במהלך הניתוח המיקרודיאליזה. להיזהר לא לשפוך שיניים עודף בטון ברחבי האתר שבו המשקל יבוטלו.
  14. השאירו את המלט להתייבש 2 דקות, ואז להסיר את הזרוע המחזיק מתוך צינורית. הכנס הסותם מפלדת אל חלד לתוך הצינורית כדי למנוע נזילות נוזל שדרתי וסיכונים של זיהום.
  15. הסר את 4 מלחציים, למשוך חזרה את העור ולתפור אותו עם חוט תפר כירורגי 4-0.
  16. להסיר את העכברוש מן המנגנון ולהזריק בופרנורפין תת-עורי לטיפול בכאב (0.05 מ"ג/ק"ג, לאחר הניתוח ואז פעם ביום במהלך 2 הימים הבאים). מניחים את המכרסמים בחזרה בכלוב עם משטח חימום תחת עד שהוא הופך מודע, ואז להחזיר אותו למתקן טיפול בעלי חיים עבור 7 ימים תקופת ההחלמה תחת פיקוח צמוד.

3. נוהל מיקרודיאליזה

  1. בעת ביצוע הליך המיקרודיאליזה, לובשים כפפות סטריליות, מצנפת שיער ומסכה כירורגית. שבעה ימים לאחר ניתוח השרשה השתלת נתרן (2.5%) ב 0.5 L/min זרימת חמצן.
  2. הסר את הסותם מן הצינורית ולהוסיף לאט בדיקה מיקרודיאליזה, מבשם עם נוזל השדרה מלאכותית מלאכותי (acsf) (26 mmol/l ' נחקו3, 3 ממול/l ' נה2פו, 1.3 mmol/l mgcl2, 2.3 ממול/l ק1, 3.0 ממול/L KCl, 126 מ מול/L ' l, 0.2 ממול/L-חומצה אסקורבית), דרך הצינורית לתוך ההיפוקמפוס או אזור אחר של עניין.
    הערה: חולדות צריך להיות מורדם רק בעת הסרת הסותם והחדרת הבדיקה microdialysis, ובמהלך אינדוקציה של זעזוע מוח או פציעה מזויף. הגששים המשמשים כאן הם מעבדה-בנוי, אני בצורת, ומורכב התמזגו זה לצד סיליקה-לשקע קווי (קוטר פנימי (ID): 50 μm] עטוף אבובים פוליאתילן (מזהה: 0.58-0.38 mm). סוף הצינורית מאובטח עם אורך של קרום התאית החלולה החלול [משקל מולקולרי לגזור: 13 kDa, קוטר החיצוני (OD): 216 μm; מזהה: 200 μm] באמצעות דבק ציאנואקרילי והקצה אטום באפוקסי. הממברנה הפעילה מודדת 2.5 מ"מ עבור השרשה בהיפוקמפוס, אך ניתן להתאימו בהתאם לעומק אזור הריבית. החיבור של צינורית שכינתה של החולדה למכשיר מאובטח עם צווארון מצויד, נירוסטה הליכי.
  3. לתקן את הרכבת בדיקה למעיין פלדת אל-חלד קשורה מסתובב נוזלי זרוע מנוף הדלפק מושעה מעל הכלוב עם מעמד טבעת ומלחציים כך בעלי חיים יכולים לנוע בחופשיות בתוך הכלוב שלה. חולדות קשור לבלות את כל המשך של הליך מיקרודיאליזה עם גישה למים למטה למזון.
  4. השתמש במשאבה מיקרואינפוזיה כדי לשלוח מבשם לבדיקות, ולאסוף את הדיפוסט מן הצינור התמזגו סיליקה לשקע (נפח מת: 0.79 μL).
  5. לפחות 1 h ו -30 דקות לפני ההליך מתחיל, להפוך את הגשוש לקצב זרימת העבודה שלו (1 μL/min). ודא שקצב הזרימה של הגשוש עקבי באמצעות מדידת הנפח לאורך זמן עם הפיפטה.
    הערה: קצב הזרימה יכול להיות פחות או יותר בהתאם לנוירוטרנסמיטורים שנדגמו ולאזור המוח של העניין. דגימות דיאליזה נלקחים לפני, במהלך, ואחרי זעזוע מוח או השראה חבלה. מרווח דגימה תלוי באזור המוח של עניין, נוירוטרנסמיטורים מנותח, הדיפוסט ריכוזים של האנליטה, ואת הרגישות של ציוד כימיה אנליטית המשמשים. השלבים האוספים שנעשו כאן בהיפוקמפוס עבור גלוטמט ודגימת הנגבה הם כדלקמן:
    1. בסיס: בתחילת הניסוי, לאסוף דגימות דיאליזה במרווחי זמן של 10 דקות עבור 60 דקות.
    2. Post-זעזוע או פציעה מזויפת: לאחר זעזוע מוח או חבלה, לאסוף דגימות עבור 90 מינימום נוספים (9 דגימות).
  6. לאסוף כל מדגם dialysate במבחנה שבר מראש עם 1 μL של 0.25 מול/L perchloric חומצה כדי למנוע השפלה אנליטה. מאחסנים את הדגימות ב -4 ° c לניתוח העוקב.
  7. בעקבות האוסף של הדגימה הדיאליפוסט האחרונה, מחדש את החולדה עם חרוט אף מסירת נתרן איזופלוריין (2.5%) ב 0.5 L/min זרימת חמצן.
  8. הסירי את הבדיקה המיקרודיאליזה מהצינורית, הכנס מחדש את האוטוראטור ולאחר מכן החזר את החולדה למתקן לטיפול בבעלי חיים.

4. זעזוע מנגנון התקנה

  1. לפני תחילת ההליך, לגלף משקל לשמש כדי לגרום זעזוע (קוטר 19 מ"מ) מפליז מוצק כדי להשיג מסה של 450 g. הכנס לולאת מתכת בראש משקל הפליז. לקדוח חורים ראשוניים במרחק של 1.0 מטר בתוך צינור פוליוויניל כלוריד אנכי (PVC) מדריך.
  2. לחתוך סדין אלומיניום. עם סכין גילוח חדה גיליון אלומיניום מרושל צריך לתמוך במשקל של החולדה (295 כדי 351 g) מבלי להפריע האצת הגוף שלה לאחר ההשפעה הראש ממשקל פליז.
  3. הקלטת את הגיליון אלומיניום מרושל בחוזקה על מסגרת פרספקס מעוצבת (38 ס"מ ארוך x 27 ס"מ רחב x 30 ס"מ עמוק, איור 3A, B) המכיל כרית קצף (37 ס"מ אורך x 26 ס"מ רחב x 12 ס מ עמוק).
  4. מקמו את מסגרת הפרספקס תחת צינור PVC מדריך (20 מ"מ קוטר x 1.5 m אורך).
  5. החזק את צינור מדריך PVC במקום עם מהדק לעמוד 3.5 ס מ מעל אלומיניום משופע.
  6. לצרף את קו הדייג לטוס ניילון (קיבולת של 9.1 ק ג, 0.46 מ"מ קוטר) דרך לולאה מתכת כך התחתית של המשקל נתקע 2.5 ס"מ מעל אלומיניום מרופדת כדי למנוע כניסות מרובות כאשר החולדה נופלת על כרית קצף לאחר ההשפעה.
  7. חברו את קו הדיג של לטוס הניילון למעמד המלחציים.
  8. משוך את המשקל דרך צינור PVC עם קו הדיג לטוס ניילון ולאחר מכן לשמור אותו במקום על ידי הוספת מפתח hex דרך החורים קדח מקדמי ב 1.0 m.

5. זעזוע האינדוקציה

  1. לאחר השלב הבסיסי של אוסף דגימות דיאליזה, מחדש את העכברוש בקלות על ידי הצבת חרוט אף מסירת נתרן איזופלוריין (2.5% איזופלוריין ב 0.5 L/min זרימת חמצן) עד שהוא כתשובה לא צביטה הבוהן (כפי שהוזכר בסעיף 3.1).
  2. הניחו את החיה על חזהו על הסדין האלומיניום המשכן, כך שראשה ממוקם ישירות בנתיב משקל הפליז (איור 3 ג, ד). לשמור על הרדמה עם חרוט האף כדי לוודא העכברוש לא זז או להתעורר לפני המשקל מכה.
  3. הסר את חרוט האף ומשוך את המפתח hex. המשקל ייפול אנכית דרך צינור ה-PVC וישפיע על ראש החולדה. החולדה תעבור סיבוב 180 ° מהיר הקרקע על גבו (איור 3E).
  4. להסיר את העכברוש מכרית קצף ולמקם אותו בגב שלו בכלוב.
  5. השתמש בשעון שעון דיגיטלי כדי למדוד את זמן הרפלקס המשמש כסימן להתאוששות וחומרת הפציעה. זמן הרפלקס הוא הזמן הכולל מן ההשפעה עד המכרסמים מתעוררים ובאופן ספונטני עצמם למצב מועדים מהמיקום פרקדן, או להתחיל ללכת. , שימו לב לסימני מוות. שבר או דימום
    הערה: ניתן לחזור על התהליך באותו נושא בנקודות זמן שונות לזעזוע מוח חוזר ונשנה.

6. שאם אינדוקציה

  1. לאחר השלב הבסיסי של אוסף דגימות דיאליזה, מחדש את העכברוש בקלות על ידי הצבת חרוט אף מסירת נתרן איזופלוריין (2.5%) ב 0.5 L/min זרימת חמצן עד שהוא לא מגיב לצביטה בבוהן (כפי שהוזכר בסעיף 3.1).
  2. הניחו את החיה על חזהו על הסדין האלומיניום המשכן, כך שראשו מניח ישירות בדרכו של משקל הפליז. לשמור על הרדמה עם חרוט האף כדי לוודא העכברוש לא זז או להתעורר.
  3. הסר את חרוט האף ולהסיר את החיה מגיליון אלומיניום בלי למשוך את המפתח hex. החולדה לא תעבור סבב מהיר של 180 °.
  4. מניחים את העכברוש על גבו בכלוב.
  5. השתמש בשעון שעון דיגיטלי כדי למדוד את זמן ההצתה כאינדיקטור לשחזור נוירולוגי.

7. כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים

  1. לקבוע רמות הנוירוטרנסמיטור (כלומר, גלוטמט ו-נגבה) על ידי להדריזציה מראש באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים עם גילוי מהיר של הפרדה פלואורסצנטית, ומערכת המורכבת של אוטומטי הפרדה מהירה ומשאבה מצמידים ל-3.0 x 50 mm 5 יקרומטר טור אנליטי.
  2. הכינו שלב נייד עם 100 ממול/L נתרן פוספט dibasic (Na2hpo4), 3.5% acetonitrile ו 20% מתנול. להתאים את ה-pH ל 6.7 עם חומצה זרחתית (85%) לפי הצורך.
  3. הגדר את קצב הזרימה ל-0.5 mL/min.
  4. הכינו ריאגנטים ללעג יומי טרי ותקני עבודה (100 ng/mL) מפתרונות מניות. העמיסו אותם לתוך קירור (10 ° c) הפרדה אוטומטית עם דגימות.
  5. מערבבים כל שבר ברציפות לתוך הטור האנליטי עם 20 μL של חומצה 3-mercaptopropionic (0.071 מול/L) מדולל עם H2O ו 20 μl של O-phthaldehyde (0.0143 מול/l) מדולל עם 0.1 מול/l נתרן tetrביטול. לאפשר 10 דקות כדי שילוב להגיב.
  6. כדי למנוע זיהום של דגימות הבא, לשטוף את לולאת ההזרקה עם מתנול (20%), לאחר כל זריקה.
    הערה: זמן השמירה גלוטמט יהיה של 1 דקות בערך בפרוטוקול זה, עבור זמן ריצה כולל של 30 דקות עבור כל מדגם.
  7. במהלך ניתוח של פסגות כרומאטוגרפיות, זהה פסגות לא ידועות באמצעות דגימות מותאמות לפי זמן ההחזקה מסטנדרטים ידועים. רמות אקספרס של אנליטים כ-μg/mL.

8. היסטולוגיה

  1. חודש לאחר הליך מיקרודיאליזה וזעזוע מוח או פגיעה מזויפת, להרדים את בעלי החיים על ידי הזרקת קוקטייל של קטמין (70 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג/ק"ג) intraperitoneally והמתת אותם על ידי פאראפורמלדהיד (4%) והפרזיה.
  2. לערוף את ראשו של המכרסמים. ואז לנתח את המוח
  3. לאחסן את המוח ב פאראפורמלדהיד (4%) ולאחר מכן הקפאת אותם בתמיסה של סוכרוז (30%).
  4. פורסים את המוח בסעיפים ילתית של 50 יקרומטר עם קריוסטט.
  5. כתם את פרוסות המוח עם cresyl סגול עבור אימות היסטולוגית של פציעה מיקום בדיקה (כתמי Nissl).

Representative Results

באמצעות המודל שלנו של זעזוע מוח המשלב כוח וסיבוב עם מיקרודיאליזה המוח vivo, גלוטמט מסחטות חריפה ושינויי הקשר במהלך הזמן בעקבות זעזוע מוח או בטעות נחקרו בשנת 21 זכר, מבוגר, החולדות ג ' ספראג-דאולי על ידי השרשה של צינורית מדריך באזור CA1 של ההיפוקמפוס.

אימות היסטולוגית של מיקום בדיקה ופציעה
אין שינויים מורפולוגיים כגון דימום גרם מסיבי או חבורות דווחו בעקבות אימות היסטולוגית של נזק רקמות ההיפוקמפוס על סעיפים מוכתם עם cresyl סגול. מדריך צינורית השרשה והחדרת בדיקה מיקרודיאליזה המושרה נזקים משניים ודומים בין המקרים הפגועים והמזויפים. יתר על כן, לא הסרת המכשיר הנכון לפני פציעה מזויף או זעזוע השראה לא להניב כל נזק רקמות ההיפוקמפוס להבדיל כפי שנראה תחת מיקרוסקופ (איור 2b, C, בהתאמה), עם קרום של החללית עדיין שלמים לאחר מכן (איור 2D, E). זעזוע מוח וחבלה מזויפים מהמוח עם פאראפורמלדהיד (4%) 1 חודש לאחר הליכי מיקרו-דיאליזה זהים בבדיקה חזותית (איור 2F, G).

הצתה בזמן רפלקס
בעלי חיים מהקבוצה הפצועה הגדילו באופן משמעותי את הזמן הגובר על הממוצע לעומת המקרים המזויפים (t-test של הסטודנט, p = 0.042801) (איור 4) והופיעה המומה מההגעה להכרה. מתוך 10 המקרים של הקבוצה זעזוע מוח, בעל חיים יחיד הראה סימנים קטין של דימום מתחת לאתר ההשפעה לאחר ירידה במשקל. שום סימנים אחרים של שבר בגולגולת. או דימום תוך גולגולתי לא נצפו

במיקרודיאליזה vivo מוחית
כדי לפעול כתוצאות מייצגות של השיטה שלנו, 15 10 μL דגימות של דיאליפוסט חולצו מן ההיפוקמפוס, ב vivo, במרווחי זמן של 10 דקות ושיעור הזרימה של 1 μL/min. רמות המיחלץ של גלוטמט ו-נגבה נמדדו מ 6 דגימות במהלך התוכנית הבסיסית ( 60 דקות) ומתוך 9 דגימות האינדוקציה של פציעה מזויפת או זעזוע מוח (90 דקות).

ריכוזי מסחטות של גלוטמט
עליות משמעותיות ריכוזי גלוטמט מסחטות נצפו באזור CA1 של ההיפוקמפוס במהלך 10 דקות הראשון הבאים אינדוקציה של טראומה לעומת פציעה מזויף (מאן-ויטני U מבחן, p = 0.009175) (איור 5). אין הבדל אחר ריכוזי גלוטמט נצפו בין קבוצות בכל נקודת זמן אחרת.

ריכוזי מסחטות של נגבה
לא שינוי משמעותי ריכוזי הנגבה נצפו באזור CA1 של ההיפוקמפוס במהלך 10 דקות הראשון הבאים אינדוקציה של טראומה לעומת פציעה מזויף (מאן-ויטני U מבחן, p = 0.943861) (איור 6). לא היה הבדל משמעותי נוסף בריכוזי הנגבה בכל נקודת זמן אחרת בין מקרי זעזוע מוח ומקרי פציעה מזויפים.

Figure 1
איור 1: חלוקה סכמטית של פרוטוקול המחקר. נתון זה השתנה מ-IO 2018. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אימות היסטולוגית של מיקום בדיקה ופציעה. (א) מבט coronal של בדיקת מיקרודיאליזה ומדריך השמה באתר ההשמה בהיפוקמפוס באמצעות האטלס הסטריאוטקאית של Paxinos ו ווטסון. (ב) מיצג של בדיקת מיקרודיאליזה ובאמצעות צינורית הדרכה מתוך מקרה חבלה מזויף. (ג) מייצג הבית היוצר של נזק רקמות ההיפוקמפוס (cresyl סגול) המיוצר על ידי בדיקה מיקרודיאליזה וצינורית מדריך מתוך מקרה זעזוע מוח. (ד) נציג מיקרודיאליזה של בדיקה לפני האינדוקציה של זעזוע מוח. (ה) מיצג של מיקרודיאליזה, לאחר אינדוקציה של זעזוע מוח. . הקרום עדיין שלם (F-G). מייצג הנציג של התחזות (F) ו זעזוע מוח (G) נפצע בעקבות זלוף עם 4% פאראפורמלדהיד בחודש אחד לאחר פציעה מזויף או זעזוע הליך. עם בדיקה חזותית, שני המוחות אינם זהים. נתון זה השתנה מ-IO 2018. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מכשירי זעזוע מוח מכשירים מיקרודיאליזה תיאורים חיוניים רכיבים. (א) תצלום של המכלול כולו מורכב של צינור פוליוויניל כלוריד אנכי (PVC) למשקל נופל ממוקם מעל שלב החולדה, מסגרת פרספקס, כרית קצף, משאבת מיקרואינפוזיה מבוקרת מחשב, מזרקים הדוקים, נוזלי swivels, ו זה לצד זה התמזגו סיליקה לשקע הצינורות. (ב) ייצוג סכמטי של מסגרת הפרספקס וכרית קצף עם כל הממדים הרלוונטיים. (ג) תצלום של פיסת רדיד אלומיניום מרופדת המשמש כשלב החולדה מעל כרית קצף. (ד) תצלום המציג את מיקום העכברוש על הבמה מיד לפני השפעת הראש על ידי משקל הנפילה. (ה) תצלום המציג את החולדה לאחר הפגיעה בראש, הממחישות את הסיבוב האופקי 180 ° של הגוף של החולדה לאחר ההשפעה הראש והאצה שלאחר הסיבוב. נתון זה השתנה מ-IO 2018. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: זמן הצתה. היסטוגרמה ייצוגים של הזמן נלקח על ידי חולדות להתעורר מן ההרדמה ולהעיף מהמיקום פרקדן למצב נוטה או להתחיל הליכה בעקבות זעזוע מוח (יהלומים אדומים, n = 10) או פציעה מזויף (ריבועים כחולים, n = 11). חולדות מקבוצת זעזוע המוח עברו זמן רב יותר באופן משמעותי לעומת קבוצת הפציעות המזויף. ערכים מרעים מיוצגים כקו אופקי בכל גרף. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001. נתון זה השתנה מ-IO 2018. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ריכוזי מסחטות של גלוטמט. מתכוון ריכוזי החילוץ של גלוטמט (μg/mL) נמדד על ידי microdialysis בהיפוקמפוס במהלך הבסיס (60 דקות) ואחרי זעזוע מוח (יהלומים אדומים, n = 10) או פציעה מזויף (ריבועים כחולים, n = 11) תנאים (90 דקות). קווי שגיאה מייצגים את השגיאה הסטנדרטית של ממוצע. * P < 0.05, * * P < 0.01, * * * P < 0.001. נתון זה השתנה מ-IO 2018. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: ריכוזי מסחטות של נגבה. מתכוון ריכוזי החילוץ של נגבה (μg/mL) נמדד על ידי microdialysis בהיפוקמפוס במהלך הבסיס (60 דקות) ואחרי זעזוע מוח (יהלומים אדומים, n = 10) או פציעה מזויף (ריבועים כחולים, n = 11) תנאים (90 דקות). קווי שגיאה מייצגים את השגיאה הסטנדרטית של ממוצע. * P < 0.05, * * P < 0.01, * * * P < 0.001. נתון זה השתנה מ-IO 2018. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

שלבים קריטיים בפרוטוקול
עבור הדור של תוצאות אמינות, צעדים קריטיים בפרוטוקול זה דורשים תשומת לב מיוחדת. במהלך ניתוח השרשה, הימנע משימוש בצמנט יותר מהנדרש, במיוחד כאשר הוא מאוד נוזלי למניעת שפיכת האתר לפגיעה. כדי למנוע חסימת אתר ההשתלה, השתמש באוטוראטור באורך זהה לזה של הצינורית. במהלך הניתוח המיקרודיאליזה, הכנס את המקדח לאט לתוך הצינורית וודא שהוא מוכנס לחלוטין לדגימה דיאליפוסט. לפני האינדוקציה זעזוע, לוודא את הגיליון אלומיניום מוכנס כראוי עם להב תער חדה. אחרת, ההשפעה של משקל פליז לא יהיה מספיק כדי לקרוע את גיליון האלומיניום ואת העכברוש יישאר החזה למטה במקום עובר סיבוב 180 ° ונחיתה על גבו. אם זה המקרה, פציעות המושרה נובע השפעה קהה, לא כמו מה שנראה הגולגולת פתוח במשקל מודלים ולהיות חמור יותר באופן משמעותי. במהלך האינדוקציה זעזוע, להימנע מפגיעה הצינורית עם המשקל כמו זה יפיק נזק קריטי לגולגולת של החולדה. מומלץ מאוד לעבוד בצוותים של 2 כדי להגביל שגיאות מניפולציה במהלך הניסוי.

שינויים ופתרון בעיות
במהלך הליך מיקרודיאליזה, הזרימה צריכה להיות קבועה ולהניב נפח המתאים לקצב הפרזיה, ברגע שהמקדח מקושר למשאבה. אמצעי אחסון נמוכים יותר יכולים להצביע על נוכחות של סתימת הקרום של בועות הגשוש או האוויר בקווים. במקרה של סתימת המכשיר צריך להיות מושלך ומוחלף עם זאת, בועות אוויר יכול להיות נפלט על ידי במחזור ACSF בקווים. אם אין סתימת או בועות אוויר ציין ועדיין אין זרימה, חלק קטן של צינור האוורור הקרוב ביותר לסוף ניתן לגזור.

מגבלות השיטה
מחקרים אחרים באמצעות משקל מדינת ויין האוניברסיטה שחרור העריכו כמה שינויים בסיסיים מבניים ומולקולריים18. עם זאת, חקירה נרחבת יותר תחזק את הלגיטימיות של הליך זה. מידע בנוגע לשינויים הביולוגיים והנוירואנטומיים המתרחשים ברמות אפיגנטיות וסלולריות, יחזק את הערך האמין והטרנסג של השיטה שלנו. יתר על כן, הערכה של תפקוד קוגניטיבי הוא מידה אמינה של התוצאה הקשורה mTBI במודלים מכרסמים33. בעוד שהזמן-לימין נמדד בפרוטוקול זה והוא עוכב באופן משמעותי במקרים פגועים בהשוואה למקרים מזויפים, מחקרים בעתיד צריכים להתרכז במדידת התפקוד הקוגניטיבי לאחר הטראומה אצל מכרסמים.

משמעות השיטה ביחס לשיטות קיימות/חלופיות.
המשמעות העיקרית של השיטה היא כפולה: ראשית, היא מאפשרת השראה מוצלחת של זעזוע מוח עם ההליך של אוניברסיטת וויין המדינה, אשר מאפשר האצה והאטה מהירה של הראש והגוף. בשיטה זו נמנעו תוצאות פגיעות חמורות כגון מעצרים, שבר בגולגולת, תמותה גבוהה וסימנים של חבורות מוחין גלויות באתר הפגיעה. שנית, זה מיקרודיאליזה טכניקה משוכפל בהצלחה הפגינו בעבר את הגרסה החריפה של גלוטמט וקצרת טווח מקבל מקום בתוך 10 דקות הראשון לאחר הטראומה האינדוקציה14,16. יתר על כן, שמירה על הגשוש מוכנס לאורך כל ההליך כולו מפחית באופן משמעותי את הסבירות של גרימת נזק מכשול המוח בדם-רגיש של mTBI מקושר החדרת בדיקה חוזרת מיקרודיאליזה34.

יישומים עתידיים או כיוונים של השיטה.
בהינתן היבטים קלים לשימוש של ויין המדינה משקל שחרור ההליך הליך מאזן חריפה ברמת נוירוטרנסמיטור שינויים נמדד על ידי microdialysis, מודל החולדה שלנו שילוב microdialysis וזעזוע מספק החוקרים עם אמינות כלי כדי להיות מתרבה בנאמנות את הביומכניקה של טראומה הגולגולת האנושית וlongitudinally לאפיין את ההשפעות המולקולריות של זעזוע מוח. מודל החולדה שלנו יכול לשמש גם במגוון רחב של מחקרים תרפוולוגיים כפי שהוא מציע הזדמנות חשובה ללמוד את המנגנון ואת היעילות של הסוכנים הפרמקוקולוגי בvivo, ברציפות ומבלי להקריב את החיה. יתר על כן, הזמינות של מודל חולדה כמו זה המוצג כאן יכול להקל מאוד את ההבנה הטובה ביותר של הקשר בין חוסר איזון הנוירוטרנסמיטר ואת ההשלכות ההתנהגותית של זעזוע מוח.

Disclosures

לא קיימים אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

אנו אסירי תודה ללואי Chiocchio עבור טיפול בעלי חיים ותחזוקה, מורגן Regniez לסיוע עם הליך היתוך התאיים, ו דוד Castonguay לסיוע עם קריוסטט. העבודה הזאת נתמכת על ידי הקתדרה על ידי הקרן של קרוליין דוראנד בטראומה חריפה של אוניברסיטת מונטריאול, שזכתה ב-LDB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal Preparation
Sprague Dawley Rats Charles River Laboratories SAS SD 40
Name Company Catalog Number Comments
Microdialysis Guide Cannula Implantation Surgery
Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml) Bioniche 1989529
Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml) Bimeda 8XYL004C
Solution of Chlorhexidine Gluconate 2% and Isopropyl Alcohol 2% Carefusion 260100C
Lidocaine Hydrochloride Alveda Pharma 0122AG01
Bupivacaine Hydrochloride Hospira 1559
Ophthalmic Ointment Baussh and Lomb inc. 2125706
Stereotaxic Frame Stoelting 51600
Stereotaxic Cannula Holder Arm Harvard Apparatus 72-4837
Drill Dremel 8050-N/18
Suture Thread Coated Vicryl Rapide 4-0 Ethicon VR2297
Dental Acrylic Cement Harvard Apparatus 72-6906
Screws JI Morris Company P0090CE125
Isoflurane Baxter CA2L9100
Cannula Gauge 20 10.55mm HRS Scientific C311G/SPC
Dummy-Cannula 10.55mm HRS Scientific C311DC/1/SPC
Name Company Catalog Number Comments
Microdialysis Procedure
CMA 402 Syringe Pump Harvard Apparatus Canada CMA-8003110
Microsyringe 2.5ml Glass Harvard Apparatus Canada CMA-8309021
Syringe Clip Medium For 1-2.5ml Harvard Apparatus Canada CMA-3408310
Low-Torque Dual Channel Quartz-Lined Swivel Instech Laboratories Inc. 375/D/22QM
GSC Cast Iron Support Ring Stand Fisher Scientifique S13748
Fisherbrand Castaloy Adjustable-Angle Clamps Fisher Scientifique 05769Q
NaHCO3 Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich Canada S5761-500G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
MgCl2 Magnesium Chloride Sigma-Aldrich Canada M8266-100G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaCl Sodium Chloride Sigma-Aldrich Canada S7653-1KG For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
L-Ascorbic Acid Sigma-Aldrich Canada A5960-25G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
KCl Potassium Chloride Sigma-Aldrich Canada P9333-500G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaH2PO4 Sodium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich Canada S0751-1KG For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
CaCl2 Calcium Chloride Sigma-Aldrich Canada 383147-100G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
Lighter Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Epoxy Glue Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Super Glue Gel Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Heat Shrink Tube 0.063" Inner Diameter Gardner Bender Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Cut-Off Wheels Dremel #409 Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
BD Needle 26 Gauge 0.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305111 Fisher Scientifique 14-826-15 For Laboratory Constructed Probes
BD Needle 21 Gauge 1.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305167 Fisher Scientifique 14-826-5B For Laboratory Constructed Probes
26G Stainless Steel Tubing One Foot HRS Scientific SST-26/FT For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/20 .024" OD X .015" ID HRS Scientific C315CT For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/10 .024" OD X .011" ID HRS Scientific C314CT For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/50 .038" OD X .023" ID HRS Scientific C313CT For Laboratory Constructed Probes
30S WIRE ST.ST 0.008X 1’ Long HRS Scientific 008BSH/30S For Laboratory Constructed Probes
Polymicro Technologies Flexible Fused Silica Capillary Tubing Inner Diameter 50µm, Outer Diameter 150µm Molex LLC Polymicro Technologies 106815-0015 For Laboratory Constructed Probes
Spectra Por 132294 Micro-Dialysis Hollow Fiber Membranes 13 kD MWCO Spectrum Labs FSSP9778671 For Laboratory Constructed Probes
Stainless Steel Collar Sirnay In.c 304 For Laboratory Constructed Probes / Custome made
Name Company Catalog Number Comments
Concussion Apparatus
Brass Weight Rapido Métal Inc. Attach metal loop to base
Metal Loop Rona Inc. Available at most hardware stores
PVC Guide Tube Rona Inc. Available at most hardware stores
Alluminum Foil Alcan Available at most grocery stores
Tape Available commercially
GSC Cast Iron Support Ring Stand Fisher Scientifique S13748
U-Shaped Plexiglas Frame Présentoirs PlexiPlus Inc. Custom made
Foam Cushion Mousse D&R Foam Inc. Custom made
Razor Blades VWR International 55411-055
Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley Canadian Tire Available at most hardware stores
Isoflurane Baxter CA2L9100
Stop Watch Available at most sporting goods retailer
Animal Preparation
Sprague Dawley Rats Charles River Laboratories SAS SD 40
Name Company Catalog Number Comments
Microdialysis Guide Cannula Implantation Surgery
Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml) Bioniche 1989529
Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml) Bimeda 8XYL004C
Solution of Chlorhexidine Gluconate 2% and Isopropyl Alcohol 2% Carefusion 260100C
Lidocaine Hydrochloride Alveda Pharma 0122AG01
Bupivacaine Hydrochloride Hospira 1559
Ophthalmic Ointment Baussh and Lomb inc. 2125706
Stereotaxic Frame Stoelting 51600
Stereotaxic Cannula Holder Arm Harvard Apparatus 72-4837
Drill Dremel 8050-N/18
Suture Thread Coated Vicryl Rapide 4-0 Ethicon VR2297
Dental Acrylic Cement Harvard Apparatus 72-6906
Screws JI Morris Company P0090CE125
Isoflurane Baxter CA2L9100
Cannula Gauge 20 10.55mm HRS Scientific C311G/SPC
Dummy-Cannula 10.55mm HRS Scientific C311DC/1/SPC
Name Company Catalog Number Comments
Microdialysis Procedure
CMA 402 Syringe Pump Harvard Apparatus Canada CMA-8003110
Microsyringe 2.5ml Glass Harvard Apparatus Canada CMA-8309021
Syringe Clip Medium For 1-2.5ml Harvard Apparatus Canada CMA-3408310
Low-Torque Dual Channel Quartz-Lined Swivel Instech Laboratories Inc. 375/D/22QM
GSC Cast Iron Support Ring Stand Fisher Scientifique S13748
Fisherbrand Castaloy Adjustable-Angle Clamps Fisher Scientifique 05769Q
NaHCO3 Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich Canada S5761-500G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
MgCl2 Magnesium Chloride Sigma-Aldrich Canada M8266-100G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaCl Sodium Chloride Sigma-Aldrich Canada S7653-1KG For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
L-Ascorbic Acid Sigma-Aldrich Canada A5960-25G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
KCl Potassium Chloride Sigma-Aldrich Canada P9333-500G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaH2PO4 Sodium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich Canada S0751-1KG For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
CaCl2 Calcium Chloride Sigma-Aldrich Canada 383147-100G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
Lighter Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Epoxy Glue Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Super Glue Gel Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Heat Shrink Tube 0.063" Inner Diameter Gardner Bender Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Cut-Off Wheels Dremel #409 Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
BD Needle 26 Gauge 0.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305111 Fisher Scientifique 14-826-15 For Laboratory Constructed Probes
BD Needle 21 Gauge 1.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305167 Fisher Scientifique 14-826-5B For Laboratory Constructed Probes
26G Stainless Steel Tubing One Foot HRS Scientific SST-26/FT For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/20 .024" OD X .015" ID HRS Scientific C315CT For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/10 .024" OD X .011" ID HRS Scientific C314CT For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/50 .038" OD X .023" ID HRS Scientific C313CT For Laboratory Constructed Probes
30S WIRE ST.ST 0.008X 1’ Long HRS Scientific 008BSH/30S For Laboratory Constructed Probes
Polymicro Technologies Flexible Fused Silica Capillary Tubing Inner Diameter 50µm, Outer Diameter 150µm Molex LLC Polymicro Technologies 106815-0015 For Laboratory Constructed Probes
Spectra Por 132294 Micro-Dialysis Hollow Fiber Membranes 13 kD MWCO Spectrum Labs FSSP9778671 For Laboratory Constructed Probes
Stainless Steel Collar Sirnay In.c 304 For Laboratory Constructed Probes / Custome made
Name Company Catalog Number Comments
Concussion Apparatus
Brass Weight Rapido Métal Inc. Attach metal loop to base
Metal Loop Rona Inc. Available at most hardware stores
PVC Guide Tube Rona Inc. Available at most hardware stores
Alluminum Foil Alcan Available at most grocery stores
Tape Available commercially
GSC Cast Iron Support Ring Stand Fisher Scientifique S13748
U-Shaped Plexiglas Frame Présentoirs PlexiPlus Inc. Custom made
Foam Cushion Mousse D&R Foam Inc. Custom made
Razor Blades VWR International 55411-055
Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley Canadian Tire Available at most hardware stores
Isoflurane Baxter CA2L9100
Stop Watch Available at most sporting goods retailer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cassidy, J. D., et al. Incidence, risk factors and prevention of mild traumatic brain injury: results of the WHO Collaborating Centre Task Force on Mild Traumatic Brain Injury. Journal of Rehabilitation Medecine. 43, 28-60 (2004).
  2. McCrory, P., et al. What is the definition of sports-related concussion: a systematic review. British Journal of Sports Medecine. 51 (11), 877-887 (2017).
  3. McCrory, P., et al. 5th International Conference on Concussion in Sport (Berlin). British Journal of Sports Medecine. 51 (11), 837 (2017).
  4. Cernak, I. Animal models of head trauma. NeuroRx. 2 (3), 410-422 (2005).
  5. Davis, A. E. Mechanisms of traumatic brain injury: biomechanical, structural and cellular considerations. Critical Care Nursing Quarterly. 23 (3), 1-13 (2000).
  6. Gaetz, M. The neurophysiology of brain injury. Clinical neurophysiology : official journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 115 (1), 4-18 (2004).
  7. Giza, C. C., Hovda, D. A. The new neurometabolic cascade of concussion. Neurosurgery. 75, Suppl 4. S24-S33 (2014).
  8. Guerriero, R. M., Giza, C. C., Rotenberg, A. Glutamate and GABA imbalance following traumatic brain injury. Current neurology and neuroscience reports. 15 (5), 27 (2015).
  9. Meldrum, B. S. Glutamate as a neurotransmitter in the brain: review of physiology and pathology. Journal of Nutrition. 130 (4S Suppl), 1007S-1015S (2000).
  10. Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297 (5868), 681-683 (1982).
  11. Olton, D. S., Papas, B. C. Spatial memory and hippocampal function. Neuropsychologia. 17 (6), 669-682 (1979).
  12. Ray, S. K., Dixon, C. E., Banik, N. L. Molecular mechanisms in the pathogenesis of traumatic brain injury. Histology and histopathology. 17 (4), 1137-1152 (2002).
  13. Reger, M. L., et al. Concussive brain injury enhances fear learning and excitatory processes in the amygdala. Biological Psychiatry. 71 (4), 335-343 (2012).
  14. Faden, A. I., Demediuk, P., Panter, S. S., Vink, R. The role of excitatory amino acids and NMDA receptors in traumatic brain injury. Science. 244 (4906), 798-800 (1989).
  15. Folkersma, H., et al. Increased cerebral (R)-[(11)C]PK11195 uptake and glutamate release in a rat model of traumatic brain injury: a longitudinal pilot study. Journal of neuroinflammation. 8, 67 (2011).
  16. Katayama, Y., Becker, D. P., Tamura, T., Hovda, D. A. Massive increases in extracellular potassium and the indiscriminate release of glutamate following concussive brain injury. Journal of neurosurgery. 73 (6), 889-900 (1990).
  17. Nilsson, P., Hillered, L., Ponten, U., Ungerstedt, U. Changes in cortical extracellular levels of energy-related metabolites and amino acids following concussive brain injury in rats. Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 10 (5), 631-637 (1990).
  18. Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of neuroscience. 203 (1), 41-49 (2012).
  19. Dewitt, D. S., Perez-Polo, R., Hulsebosch, C. E., Dash, P. K., Robertson, C. S. Challenges in the development of rodent models of mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 30 (9), 688-701 (2013).
  20. Eisenberg, M. A., Andrea, J., Meehan, W., Mannix, R. Time interval between concussions and symptom duration. Pediatrics. 132 (1), 8-17 (2013).
  21. Guskiewicz, K. M., et al. Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study. JAMA. 290 (19), 2549-2555 (2003).
  22. Luo, J., et al. Long-term cognitive impairments and pathological alterations in a mouse model of repetitive mild traumatic brain injury. Frontiers in neurology. 5, 12 (2014).
  23. Meehan, W. P. 3rd, Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing recovery time between injuries improves cognitive outcome after repetitive mild concussive brain injuries in mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-891 (2012).
  24. Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. A. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Developmental neuroscience. 32 (5-6), 510-518 (2010).
  25. Schwetye, K. E., et al. Traumatic brain injury reduces soluble extracellular amyloid-beta in mice: a methodologically novel combined microdialysis-controlled cortical impact study. Neurobiology of disease. 40 (3), 555-564 (2010).
  26. Shitaka, Y., et al. Repetitive closed-skull traumatic brain injury in mice causes persistent multifocal axonal injury and microglial reactivity. Journal of neuropathology and experimental neurology. 70 (7), 551-567 (2011).
  27. Willie, J. T., et al. Controlled cortical impact traumatic brain injury acutely disrupts wakefulness and extracellular orexin dynamics as determined by intracerebral microdialysis in mice. Journal of neurotrauma. 29 (10), 1908-1921 (2012).
  28. Bolton, A. N., Saatman, K. E. Regional neurodegeneration and gliosis are amplified by mild traumatic brain injury repeated at 24-hour intervals. Journal of neuropathology and experimental neurology. 73 (10), 933-947 (2014).
  29. Blaylock, R. L., Maroon, J. Immunoexcitotoxicity as a central mechanism in chronic traumatic encephalopathy-A unifying hypothesis. Surgical neurology international. 2, 107 (2011).
  30. McCrory, P., Davis, G., Makdissi, M. Second impact syndrome or cerebral swelling after sporting head injury. Current Sports Medecine Reports. 11 (1), 21-23 (2012).
  31. Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage. Journal of Neurotrauma. 29 (12), 2172-2180 (2012).
  32. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , 4th edn, Academic Press. (1998).
  33. Bales, J. W., Wagner, A. K., Kline, A. E., Dixon, C. E. Persistent cognitive dysfunction after traumatic brain injury: A dopamine hypothesis. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 33 (7), 981-1003 (2009).
  34. Sumbria, R. K., Klein, J., Bickel, U. Acute depression of energy metabolism after microdialysis probe implantation is distinct from ischemia-induced changes in mouse brain. Neurochemical Research. 36 (1), 109-116 (2011).

Tags

מדעי המוח סוגיה 149 פגיעה קלה במוח טראומטית זעזוע מוח האצת ראש בvivo מיקרודיאליזה מוחית עכברוש
מודל עכברוש הרומן והטרנסלבית של זעזוע מוח שילוב כוח וסיבוב עם Vivo מוחין מיקרודיאליזה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Massé, I. O., Moquin, L.,… More

Massé, I. O., Moquin, L., Provost, C., Guay, S., Gratton, A., De Beaumont, L. A Novel and Translational Rat Model of Concussion Combining Force and Rotation with In Vivo Cerebral Microdialysis. J. Vis. Exp. (149), e59585, doi:10.3791/59585 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter