Dieses Protokoll wird verwendet, um einzelne vorhofflische Kardiomyozyten aus dem erwachsenen Mausherz mit einem Chunk-Verdauungsansatz zu isolieren. Dieser Ansatz wird verwendet, um rechte oder linke Vorhoffleine myozyten zu isolieren, die verwendet werden können, um Vorhoffleine Myozytenelektrophysiologie in Patch-Clamp-Studien zu charakterisieren.
Die elektrophysiologischen Eigenschaften von Vorhofmyozyten wirken sich vor allem auf die allgemeine Herzfunktion aus. Veränderungen in den zugrunde liegenden ionischen Strömen, die für das Aktionspotential verantwortlich sind, können proarrhythmische Substrate verursachen, die Arrhythmien zugrunde liegen, wie Vorhofflimmern, die in vielen Bedingungen und Krankheitszuständen weit verbreitet sind. Die Isolierung von vorehebrecherischer Vorhofkardiomyozyten für den Einsatz in Patch-Clamp-Experimenten hat unser Wissen und Verständnis der zellulären Elektrophysiologie im gesunden Vorhofmyokard und bei der Einstellung der vorhoffalen Pathophysiologie erheblich erweitert. Darüber hinaus haben Studien mit genetischen Mausmodellen die Rolle einer Vielzahl von Proteinen bei der Regulierung der Atrialelektrophysiologie aufgeklärt. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von Kardiomyozyten aus den Vorhofanhängchen erwachsener Mäuse unter Verwendung einer Kombination aus enzymatischer Verdauung und mechanischer Dissoziation dieser Gewebe. Dieser Ansatz liefert konsequent und zuverlässig isolierte vorgerichtliche Kardiomyozyten, die dann zur Charakterisierung der zellulären Elektrophysiologie verwendet werden können, indem Wirkungspotentiale und Ionische Ströme in Patch-Clamp-Experimenten im Rahmen einer Reihe von experimentellen Bedingungen.
Die Vorhöfe, die dünnwandigen Niederdruckkammern des Herzens, die Blut von der überlegenen und minderwertigen Venenhöhle sowie den Lungenvenen erhalten, sind integraler Bestandteil der normalen Herzphysiologie. Wie andere Regionen des Herzens, die Vorhöfe enthalten eine Reihe von Zelltypen, einschließlich Kardiomyozyten, Fibroblasten, Endothelzellen, vaskuläre glatte Muskelzellen, und andere. Vorhoffllässe Myozyten sind elektrisch erregbare Zellen, die eine wesentliche Rolle bei der Leitung elektrischer Signaledurch das Herz spielen und so eine ordnungsgemäße Vorhofkontraktion während jedes Herzschlags 1 gewährleisten. Elektrische Dysfunktion in den Vorhöfen kann zu einer Reihe von vorgericht spezifischen Arrhythmien wie Vorhofflimmern und Vorhofflimmern führen2,3. Diese sind sehr weit verbreitete, aber wenig verstandene Atrialarrhythmien, die zu einer signifikanten Morbidität und Mortalität führen. Vorhofflimmern kann in Verbindung mit genetischen Mutationen, in Verbindung mit dem Altern oder bei der Einstellung erworbener Formen von Herzerkrankungen auftreten, einschließlich Bluthochdruck, Herzinsuffizienz und Diabetes2,4,5 ,6. Diese Bedingungen können die elektrischen Eigenschaften von Vorhofmyozyten verändern, die ein Substrat erzeugen können, das die Prävalenz der Arrhythmogenese1,2erhöht.
Die normale elektrische Funktion in den Vorhöfen sowie die Atrialarrhythmogenese werden durch die Morphologie des in Vorhofmyozyten erzeugten Aktionspotentials (AP) wesentlich beeinflusst. Der vorhofische AP wird aus der Aktivität einer Reihe von Ionenströmen erzeugt, einschließlich des Natriumstroms (INa, getragen von NaV1.5 Kanälen), des L-Typ-Calciumstroms (ICa,L, getragen von Cav1.2 und CaV1.3 Kanälen). ), und mehrere Kaliumströme, einschließlich des ultraschnellen verzögerten Gleichrichters Kaliumstrom (IKur, getragen von KV1.5 Kanälen), der transiente außen Kaliumstrom (Izu, getragen von KV4.2 und KV4.3 kanäle), einen stationären Kaliumstrom (IKss, getragen von KV2.1 Kanälen) und den nach innen gerichteten Gleichrichter Kaliumstrom (IK1, getragen von Kir2.1 Kanälen)1,7, 8. Obwohl sie in den Mausvorhöfen keine große Rolle spielen, tragen die schnellen und langsamen Komponenten des verzögerten Gleichrichters K+ Strom (IKr und IKs) auch zur AP-Repolarisation bei einigen Artenbei 7bei. Veränderungen in einem oder mehreren dieser ionischen Ströme können die elektrischen Eigenschaften von Vorhofmyozyten erheblich verändern, was zu Vorhofarrhythmien führen kann. Zum Beispiel kann eine Reduzierung von INa die Leitungsgeschwindigkeit über die Vorhöfe verlangsamen, indem die AP-Aufschlaggeschwindigkeit reduziert wird. Andererseits kann eine Verringerung der repolarisierenden Kaliumströme oder eine Erhöhung entweder iCa,L oder der späten INa zur Entwicklung von Nachdepolarisationen führen, die spontane Aktivität in den Vorhöfen auslösen können1, 2,9.
Es ist wichtig zu erkennen, dass es Unterschiede in der AP-Morphologie in verschiedenen Teilen des vorhofen Myokards gibt, die wahrscheinlich auf Unterschiede in der Expression oder Regulierung dieser zugrunde liegenden Ionenkanäle zurückzuführen sind. Beispielsweise wurden Unterschiede in der AP-Dauer zwischen der rechten und linken Vorgeschichte in Verbindung mit Unterschieden in Iund stromdichte gut beschrieben10,11,12,13. Außerdem haben wir vor kurzem gezeigt, dass es verschiedene Muster des elektrischen Umbaus in der rechten und linken Vorhöfin von Mäusen mit chronischer Hypertoniegibt 6,14. Die rechte hintere Vorhofwand enthält auch den sinoatrialen Knoten, der seine eigenen Muster der AP-Morphologie und Feuermuster15hat. Die unterschiedlichen Eigenschaften von Myozyten in jedem dieser verschiedenen Teile der Vorhöfe können mit isolierten Myozyten aus jeder dieser Regionen im Detail untersucht werden.
Es gibt verschiedene Ansätze, die verwendet werden können, um vorbliche Myozyten für Patch-Clamp-Elektrophysiologie-Studien zu isolieren16. Eine Möglichkeit besteht darin, einen retrograden Perfusionsansatz zu verwenden, bei dem das Herz über die Aorta für die Abgabe von Enzymen kanüliert wird. Während dies ein praktikabler Ansatz ist, kann es Variabilität in der Atrial-Myozytenqualität aufgrund von Inkonsistenzen in der Durchblutung der Vorhöfe produzieren. Wir haben einen “Chunk”-Verdauungsansatz für die Isolierung von vorhofen Myozyten gewählt, der die Notwendigkeit einer retrograden Durchblutung des Herzens eliminiert. Unser Ansatz verwendet eine Kombination aus enzymatischer Verdauung und mechanischer Dissoziation von Vorhofgewebe, die konsequent und zuverlässig eine große Anzahl isolierter Vorhofmyozyten ergibt, die für Patch-Clamp-Studien geeignet sind. Während wir unseren Ansatz hier mit vorgerichtem Anhängselgewebe beschreiben, kann der Ansatz in jeder Region des vorgerichtlichen Myokards (d. h. rechte oder linke Vorhofanhängsel, freie Wände, hintere Wände) verwendet werden, die der Prüfer wählt. Dieser Ansatz ist ideal für Studien der Vorhoffyzelektrophysiologie bei genetisch veränderten Mäusen, in Mausmodellen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen oder für die Untersuchung der Auswirkungen pharmakologischer Verbindungen5,6,17 , 18 , 19.
Unser Labor verwendet dieses Protokoll routinemäßig, um Maus-Vorhofmyozyten für den Einsatz in Patch-Clamp-Experimenten zu isolieren, um die Auswirkungen verschiedener Formen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, genetischen Mutationen oder pharmakologischen Verbindungen auf Atrialmyozyten zu untersuchen. Elektrophysiologie. Obwohl sehr reproduzierbar, hängt die Qualität der Daten, die aus den isolierten Vorhofmyozyten erhalten werden, von der Qualität der Isolierung ab. Darüber hinaus führt die Wiedereinführung von Kalzium nach der vorbäuflinösen Myozytenisolation zu einem Zelltod für eine Population isolierter Myozyten aufgrund des Calciumparadoxons16. Dementsprechend erfordert die Isolierung tragfähiger, hochwertiger Vorhofmyozyten mit diesem Ansatz Praxis und Optimierung an mehreren Stellen in der Isolation. Einmal optimiert, Wird geschätzt, dass zwischen 70-90% der gesamten vorgericht myozyten isoliert mit diesem Ansatz wird sowohl Kalzium-tolerant und Stab geformt sein. Die Schritte, die die meiste Übung und Optimierung erfordern, werden im Folgenden erläutert.
Die Geschwindigkeit und Effizienz der Sezierung wird sich nachgelagert auf die Qualität der isolierten Zellen auswirken. Es ist wichtig, sich Zeit zu nehmen, um sicherzustellen, dass das gesamte Blut aus dem Vorhofgewebe entfernt wird und dass Gewebestreifen auf eine ähnliche Größe geschnitten werden. Es sollte etwa 5 min dauern, um das Vorhofanhängschen zu entfernen, das Gewebe in Streifen zu schneiden und die Gewebestreifen in das erste Rohr der modifizierten Tyrodes pH 6.9-Lösung zu übertragen. Wenn dieser Schritt jedoch zu lange dauert, kann die Qualität des Gewebes beeinträchtigt werden.
Es ist auch wichtig, dass Gewebestreifen in einer Isolation und zwischen Herzen auf eine einheitliche Größe geschnitten werden. Wenn Gewebestreifen zu groß oder zu klein sind oder wenn sie innerhalb einer Isolierung nicht einheitlich sind, kann dies sowohl bei der enzymatischen Verdauung als auch bei der Trituration zu Problemen führen. Dies liegt daran, dass kleine Streifen gründlicher verdaut und große Streifen unterdgetaut werden. Ebenso wichtig ist es, den untersuchten Genotyp und die Krankheitseinstellung zu berücksichtigen, da die Größe des Vorhofanhängs von Ort zu Tier variieren kann. Zum Beispiel haben hypertrophe Herzen größere Vorhofanhängsel im Vergleich zu gesunden Herzen, und daher kann der Experimentator mehr Streifen in hypertrophen Herzen schneiden als normale Herzen. Dementsprechend wird die Optimierung der Größe der geschnittenen Gewebestreifen und die Anwendung dieser Abmessungen auf jedes einzelne Vorhofanhängsband die Reproduzierbarkeit von Myozytenisolationen zwischen experimentellen Bedingungen erheblich verbessern.
Das empfindliche Gleichgewicht zwischen enzymatischer Verdauung und mechanischer Dissoziation ist der Schlüssel zu einer erfolgreichen Myozytenisolation mit diesem Protokoll. Wenn Gewebe während der enzymatischen Verdauung nicht ausreichend gewirbelt wird, neigen die einzelnen Gewebestreifen dazu, sich zu verklumpen und zusammenzukleben, was die Wirksamkeit der enzymatischen Verdauung einschränkt. Wenn zu häufig oder kräftig aufgeregt, kann dies das Vorhofgewebe schädigen, was zur Isolierung von nicht lebensfähigen Zellen führen wird. Mechanische Dissoziation von isolierten Vorhofmyozyten von Gewebestreifen während der Trituration ist der kritischste Schritt, um zu üben und zu optimieren mit diesem Ansatz, um Vorhofmyozyten zu isolieren. Wenn die Trituration zu sanft ist, ist die Zellausbeute gering. Auf der anderen Seite, wenn Trituration zu hart ist, dann wird eine Fülle von nicht lebensfähigen Myozyten isoliert werden, und die Qualität der Daten, die während Patch-Clamp-Experimente erhalten werden, wird gefährdet. Darüber hinaus kann die Zusammensetzung der Vorhöfe die Isolierung beeinflussen. Wenn beispielsweise Gewebe fibrotisch ist, müssen die enzymatische Verdauung und die Triturationsschritte möglicherweise modifiziert werden. Es ist daher wichtig, sich die Zeit zu nehmen, die Fähigkeiten zu entwickeln, die erforderlich sind, um während der Trituration qualitativ hochwertige Zellen zu erhalten, die für Patch-Clamp-Experimente verwendet werden können.
Wie bei allen experimentellen Techniken gibt es Einschränkungen. Diese Technik erfordert Praxis, um lebensfähige, qualitativ hochwertige Myozyten reproduzierbar zu isolieren, was wiederum die Durchführbarkeit aller Experimente beeinflusst, die mit diesen Myozyten durchgeführt werden sollen. Dieser Ansatz ist auch terminal und Vorhof-Myozyten, die mit diesem Ansatz isoliert sind, können nur am Tag der Isolierung verwendet werden. Unser Labor verwendet die Zellen innerhalb von 6-7 h Isolation.
Dieser Ansatz der Isolierung von vorhofen Kardiomyozyten hat mehrere Anwendungen. Zum Beispiel kann dieser Ansatz modifiziert werden, um Vorhoffleine (sowie Herz-Fibroblasten) von anderen Arten, einschließlich menschlicher Vorhofgewebebiopsien, zu isolieren. Darüber hinaus ist ein Vorteil bei der Verwendung dieser Chunk-Methode für die vorhofflische Myozytenisolation (im Gegensatz zur retrograden Perfusion des Herzens), dass sie modifiziert werden kann, um Kardiomyozyten aus anderen Regionen des Herzens zu isolieren, wie z. B. dem sinoatrialen Knoten oder anderen spezifischen Regionen. des Vorhofmyokards oder umfassen die gesamte supraventrikuläre Region des Herzens. Unser Labor verwendet vorgerichtliche Kardiomyozyten für Patch-Clamp-Experimente, um Aktionspotentiale und Ionische Ströme zu messen, obwohl dieser Ansatz nicht auf diese Technik beschränkt sein muss. Zum Beispiel können isolierte Myozyten verwendet werden, um Veränderungen in Kalziumtransienten und Kontraktilität in einer Vielzahl von experimentellen Umgebungen zu untersuchen. Atriale Kardiomyozyten können auch in Immunfluoreszenzstudien verwendet werden, um die Lage von Proteinen oder Strukturen von Interesse zu untersuchen. Dementsprechend ist dieser Ansatz mit vielen Einsatzmöglichkeiten sehr vielseitig.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wird durch Betriebskostenstipendien der Canadian Institutes of Health Research (MOP 93718, 142486) und der Heart and Stroke Foundation of Canada an R.A. Rose unterstützt. H.J. Jansen ist Träger eines Killam Postdoktorandenstipendiums.
1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N', N'-tetraacetic acid 98% | Sigma | A4926-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, > 99%, from microbial | Sigma | A7699-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt > 95%, bacterial | Sigma | A9187-1G | |
Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder | Sigma | A4888-500 MG | |
Bovine serum albumin | Sigma | A3059-50G | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
Cesium chloride ReagentPlus, 99.9% | Sigma | 289329-100G | |
Cesium hydroxide monohydrate > 99.5% trace metals basis | Sigma | 562505-1KG | |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
Creatine anhydrous | Sigma | C0780 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
DL-Aspartic acid potassium salt | Sigma | A2025-100G | |
Elastase suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS002279 | |
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid >97.0% | Sigma | E4378-25G | |
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate > 95% (HPLC), powder | Sigma | G8877-250MG | |
Heparin 10 000 USP units/10mL | SANDOZ | 10750 | |
HEPES > 99.5% (titration) | Sigma | H3375-500G | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate > 99% (HPLC), powder | Sigma | G1501-500G | |
Magnesium sulfate | Sigma | M2643-500G | |
Nifedipine > 98% (HPLC), powder | Sigma | N7634-1G | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98% | Sigma | P7936-5G | |
Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5% | Sigma | P3911-500G | |
Potassium hydroxide | EM Science | PX1480-1 | |
Potassium phosphate monobasic | EMD | PX1565-1 | |
Protease from Streptomyces griseus, type XIV, >3.5 units/mg solid, powder | Sigma | P5147-1G | |
Sodium chloride ACS reagent, > 99.0% | Sigma | S9888-2.5KG | |
Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent | Sigma | 221465-500G | |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments Inc | SYLG184 | |
Taurine | Sigma | T0625-100G | |
Tetraethylammonium chloride > 98% (titration) | Sigma | T2265-100G |